购物车 
大肠杆菌感受态细胞实验流程（实验介绍，实验所需试剂，实验步骤，实验注意事项）
Release Time：2020-07-24一、大肠杆菌感受态细胞实验简介：
二、大肠杆菌感受态细胞实验所需试剂：
LB液体培养基、、CaCl2溶液、甘油、2ml离心管、1.5ml离心管
三、大肠杆菌感受态细胞实验步骤：
1）制备大肠杆菌感受态细胞
（1）从新激活的大肠杆菌DH5α细菌平板中挑出一个菌落，将其注入3?5ml的LB液体培养基中，在37°C条件下摇动培养约12小时，直到对数生长期。将细菌悬浮液以1：100?1：50的比例放入100ml LB液体培养基中，在37℃条件下摇动并扩展，当培养液开始出现浑浊时，每20?30分钟测量OD600nm直到OD600nm≤0.5停止训练即可。
（2）每组取3份2ml的培养物，转移至2ml离心管中后，在冰上冷却大约20-30min，并以条件下4℃以4000r / min离心10min（此后，所有操作均在冰上进行，速度要快而稳定）;
（3）倒入上清培养基中，用1ml冰冷的0.1mol / L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，并冰浴；
（4）0?4℃，4000r / min离心10min;
（5）弃去上清液，加入500µll冰冷的0.1mol / L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。 0?4℃，以4000r / min离心10min；
（6）弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mol / L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。将它们放在冰上一会儿后，准备感受态细胞悬液。
（7）所制备的感受态细胞悬液可以直接进行转化实验，也可以添加约占高压灭菌甘油总体积约15％的溶液，充分混合，并分装到1.5ml离心管中，放入- 70在℃可以保存六个月至一年。
2）细胞转化
（1）取三份100µl感受态细胞悬液（如果为冷冻保存液，解冻后需立即进行操作），在第一组悬浮液中加入10µl重组质粒DNA（体积不超过10µl），此管为转化实验组。在第二组悬浮液中插入DNA片段，即消化DNA片段后将25ng 100µl感受态细胞悬浮液插入；在第三组悬浮液中分离质粒DNA，即1ng未消化的pBluescript质粒DNA十个100µl感受态细胞悬液。
（2）轻轻摇动上述样品，将其放在冰上20-30分钟，在42℃水浴中放置1-2分钟，然后在冰上快速冷却2分钟。
（3）立即在上述试管中加入0.4ml LB液体培养基（无需在冰上操作），使总体积为0.5ml。该溶液称为转化反应储备液。摇匀并在37℃摇动培养约45-60min，以恢复受体细菌的正常生长，重组转化子表达抗生素基因产物。
3）平板培养
（1）取0.1毫升每种样品培养液，将其放在含有抗生素的LB平板培养基上，并均匀铺开（如果被玻璃棒吸收，请在酒精灯燃烧后冷却下来，不要使用太多）。
（2）细菌溶液被培养基完全吸收后，将培养皿倒置，并在37摄氏度的恒温培养箱中孵育沉淀（12-16h）。当菌落生长良好且彼此不重叠时，停止培养。对于蓝白色斑点的选择对于质粒和磷脂，此时应清楚地看到蓝色和白色菌落。
通过CaCl2方法制备的感受态细胞被转化为每微克超螺旋质粒DNA 5×106-2×107个转化的菌落。在实际工作中，每微克105个以上的转化菌落就可以满足一般的克隆实验。
四、大肠杆菌感受态细胞实验注意事项：
※ 检测转化体并计算转化率、各实验组菌落的生长状况及结果分析：
⑴ 转化体总数=菌落数×（转化反应储备液总体积/包被细菌溶液的体积）；⑵ 插入频率=蓝色菌落数/白色菌落数；
⑶ 转化频率=转化子总数/添加的质粒DNA数量（计算每微克的转化菌落数）。
五、大肠杆菌感受态细胞实验所需试剂清单：
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 2ml圆底连盖离心 | F-EP020 | ||
| 2 | 10ul白吸头 | FT-10 | ||
| 3 | 1.5ml尖底连盖离心管 | F-EP015 | ||
| 4 | CaCl2 | JT0418 | 10043-52-4 | |
| 5 | LB培养基 | HC1007 | ||
| 6 | 甘油 | JT26018 | 56-81-5 |
