一、QPNC-PAGE实验简介

QPNC-PAGE实验是在典型的天然PAGE方法中，复合物通过CN-PAGE或BN-PAGE分离。然后可以将其他分离方法（例如SDS-PAGE或等电聚焦）用于进一步分离。然后切开凝胶，并分离蛋白质复合物的每个部分。可以消化蛋白质的每个条带，以进行肽段指纹分析或重新测序。这提供了有关蛋白质复合物中单个蛋白质的重要信息。

二、QPNC-PAGE的实验步骤

1.运行缓冲区

QPNC-PAGE实验实际上是一种电泳的过程，应用于在特殊设备中分离生物活性分子，在特殊的电泳缓冲液系统（基于NaN3和Tris-HCl体系）中，生物系统中的大多数蛋白质都带电荷，并在电场的正负电极之间进行迁移。尽管pH（10.00）电泳缓冲液与细胞或者组织的生理pH值之间不匹配，但是在生理pH（8.00）缓冲液系统下，蛋白质将被连续洗脱并可分成不同的部分，分离系统包括一个电泳槽以及一个分馏收集器，这些设备必须防止在冰箱中。

2、凝胶的特性

为了获得PAGE所需要的完全聚合凝胶，聚丙烯酰胺凝胶需要在室温条件下冷凝大约69小时。最终获得均匀，机械稳定并且是游离的单体或者原子。凝胶的孔径较大，因此在电泳分离实验过程中分子筛效应实际最小。正因为由于以上原因，凝胶和活性分子之间的相互作用几乎是可以忽略的。待分离的金属蛋白（例如：金属伴侣，蛋白酶感染性的主要因子，金属转运蛋白，淀粉样蛋白，金属酶，金属肽等等）不会因此被分解为载脂蛋白和金属辅因子。在QPNC-PAGE过程后，分离的蛋白质的生物学活性结构（天然或3D构象）不会发生构象变化。因此，金属蛋白和蛋白质同工型在PAGE中被定量分为高纯度级分。与2-DE，等速电泳，SDS-PAGE和CN-PAGE等其他电泳技术相比，QPNC被称为“突破方法”的实验。

3. QPNC-PAGE实验所需的试剂

①储备溶液

1）200mM的 Tris-HCl缓冲液； 10mM的 NaN3缓冲液 PH10.00，室温条件下；
2）200mM Tris-HCl缓冲液； 10mM NaN3缓冲液 PH8.00，室温条件下
3）40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C，4°C（新鲜）

※ 运行缓冲区：20mM的 Tris-HCl缓冲液； 1mM的NaN3缓冲液 PH10.00（脱气），4℃；电泳槽上部：500ml电泳缓冲液；电泳槽下部：2000ml电泳缓冲液

※ 淋洗液：20mM的 Tris-HCl缓冲液； 1mM缓冲液 NaN3 PH8.00（脱气），4℃

※ 洗脱室：700ml的洗脱缓冲液

※ 分离胶：丙烯酰胺4％T容量40ml，主要成分：4ml 40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C; 10mM NaN3溶液 PH10.00； 4ml 200mM Tris-HCl缓冲液；32 mL水; 200μL10％的APS; 20μLTEMED，添加了APS和TEMED。轻轻搅拌烧瓶中的混合物，注意不要产生气泡。然后将溶液转移到内径为28 mm，长度为40 mm的刻度玻璃柱中。加入3毫升正丙醇。聚合60分钟后，用电泳缓冲液洗涤凝胶，然后用4ml电泳缓冲液覆盖凝胶表面。在室温下凝集69小时。

※ 样品的制备以及收集：取样品（样品为生物液体）在温度4°C条件下，分离前，需要将2.7ml样品和0.3ml甘油混合均匀5分钟。混合后再将处理后的样本添加到运行缓冲区的上层。该蛋白在该电泳缓冲液中带有负电荷，样品分离纯化过程中，应该避免类似于蛋白沉淀发生，以防蛋白变性发生。化学性质比较稳定的金属蛋白可以采用非变性的凝胶渗透层析来进行进一步纯化获得。