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测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性
Release Time：2020-07-20一、测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性实验简介
二、测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性实验原理
02 - +02 - + 2H+ H2 02 +02，由于超氧阴离子自由基02的寿命短且不稳定，因此不易直接测定SOD活性，因此使用间接方法。当前有三种常用的方法，包括氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化学还原法，焦性没食子酸自氧化法和化学发光法。本实验主要介绍光化学还原法。原理是：在蛋氨酸和核黄素存在下，氮蓝四唑发生光化学还原反应，生成蓝色甲基hydr，蓝色甲基blue在560nm处具有最大的光吸收率。
SOD可抑制NBT的光化学还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。
三，测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性实验所需试剂：
1.50m mol / l pH 7.8的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。包含0.1m mol / l EDTA
2.220毫 摩/升甲硫氨酸：称3.2824克甲硫氨酸,用50毫 摩/升 pH7.8的磷酸缓冲液定溶至100ml（现配现用）。
3.1.25m mol / l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液（现已制备）：称量NBT 0.102克，使用溶解50m mol / l pH 7.8的磷酸盐缓冲盐水（PBS），并稀释至100ml。
4.0.033m mol / l核黄素：重2.52m克，用PBS溶解至200ml（储存于阴凉处）。四，实验步骤
1.酶溶液的制备：称取0.5克植物组织，加入2.5ml PBS，研磨并匀浆，然后加入2.5ml PBS并充分混合。上清液在4℃以10000r / min离心15min后为粗酶溶液。适当稀释一部分上清液，用于酶活性测定。
2.酶活性测定取7个10毫升的小烧杯，3个测试样品，4个作为对照，根据下表添加试剂：
| 所需试剂 | 试剂用量(ml ) | 最终浓度(比色时) |
| 50毫 摩/升 (PBS)
220毫 摩/升 Met 1.25毫 摩/升 NBT 0.033毫 摩/升核黄素 酶液 总体积 |
4.05
0.3 0.3 0.3 0.05 5.0 |
13毫 摩/升 75µ mol/l 2.0µ mol/l 对照以缓冲液代替酶液 |
3.蛋白质含量的测定
将步骤1的上清液适当稀释，并通过考马斯亮蓝克-250法测定蛋白质含量。
四，测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性实验结果与计算
SOD活性的单位表示为抑制NBT的光化学还原的50％的酶活性单位。可以通过计算SOD活性：
SOD总活性=SOD比活性=总SOD活性/总蛋白质浓度
式中: SOD总活性单位：U/克FW,比活力单位：U/m克蛋白，ACK是对照品(光照)的光吸收数值;AE为样品的光吸收数值;V为样液总体积,V1为测定时样品用量,W为样品克重.
