购物车 
蛋白质印迹实验怎么做
Release Time：2020-07-20一、蛋白质印迹实验介绍：
蛋白质印迹，是一种标记方法（印迹法）是指将样品转移到固相支持物上，然后使用相应的检测反应来检测一种方法。使用DNA-RNA交叉检测特定DNA片段的方法称为South标记法。后来，人们使用类似的方法标记和分析RNA和蛋白质。 RNA的分离和分析称为North标记。单向电泳后蛋白质分子的斑点分析称为蛋白质斑点法，斑点分析称为东部斑点法。
二，蛋白质印迹实验方法：
※ 蛋白质印迹（blotting）是将样品转移到固相载体上后，利用相对应的探测反应来检测样品的一种实验方法。蛋白质标记法首先将电泳后分离的蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上。通常有两种方法：插入标记法和电泳法。在湿滤纸上，将硝酸纤维素膜放在凝胶上，然后在滤纸上放一层吸水材料，然后用重物压，缓冲液将通过毛细管作用流过凝胶。
※ 当缓冲液通过凝胶时，蛋白质被带到了硝酸纤维素膜表面，硝酸纤维素膜可以通过疏水的相互作用与蛋白质进行不可逆的结合。这个持续的过程会继续升温，此时凝胶中的蛋白质基本可以转移到硝酸纤维素膜上。
该方法虽然具有较高的转移效率，但通常只能转移凝胶中约（10％?20％）的一小部分蛋白质。电泳分离可以更快速和更有效地的实现转移。该实验方法采用多孔塑料板和有机玻璃板，将凝胶以及硝酸纤维素膜夹在中间，形成了“三明治”状态，再将其浸入两个平行电极之间的缓冲液中进行电泳。选择合适的电泳方向以使蛋白质离开凝胶并结合到硝酸纤维素膜上。转移的硝酸纤维素膜称为斑点（印迹），可用于进一步的进行蛋白质的检测。
三，蛋白质印迹实验步骤：
※ 首先用蛋白质溶液（例如10％BSA）处理比对，以阻断硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，然后用待研究蛋白质的抗血清（一抗）处理，仅待研究蛋白质被分离。它与一抗结合，但其他蛋白质不与一抗结合，因此在除去未结合的一抗后，只有待研究蛋白质的位置与过滤器中的一抗结合。
※ 用适当标记的第二抗体进一步处理处理过的压缩物。二抗是指一抗的抗体。如果一级抗体是从小鼠获得的，则二级抗体是针对小鼠Ig G的抗体。经过处理后，标记的二级抗体会与一级抗体结合，这可以指示一级抗体的位置，即要研究的蛋白质。
当前，存在结合各种标志物的抗特异性Ig G抗体，并且可以作为标记的第二抗体直接购买。最常用的一种是酶联二抗。用酶联二抗处理标记后，用适当的底物溶液处理标记。当酶纯化的底物产生有色产物时，将产生可见带。指示要研究的蛋白质的位置。
※ 碱性磷酸酶可将无色底物5-溴-4-氯代二甲苯磷酸（BCIP）转化为蓝色产物。过氧化物酶可以使用H2O2作为底物将3- Amino-9-自由基咔唑氧化为棕色产品，或将4-氯苯酚氧化为蓝色产品。检测辣根过氧化物酶的另一种方法是使用增强的化学发光。辣根过氧化物酶氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基邻苯二甲酰单酯）并在H2O2存在下发光。在化学增强剂的存在下，光强度可以提高1000倍，而将辣根过氧化物酶的存在可以通过将副本放在摄影胶片上并使其敏化来检测。
除了作为指标的酶联二抗外，还可以使用其他指标，主要包括以下各项：
I125标记的二抗：可以通过放射自显影检测。
异硫氰酸荧光素标记的二抗：可以通过在紫外线下产生荧光来检测。
I125标记的金黄色葡萄球菌蛋白质A（蛋白质A）：蛋白质A可以结合到Ig G本身的Fc区，因此蛋白质A可以替代第二抗体：通过红外放射自显影检测I125标记的蛋白质A。
金标记的二抗：二抗包装有微小的金颗粒，与一抗结合使用时可能会显示红色。生物素偶联的二抗：用生物素偶联的二抗过滤后，用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的凝集素处理。生物素可以与凝集素紧密结合。该方法实际上等效于通过生物素和凝集素的紧密结合将二抗与酶连接，并且可以通过酶的显色反应进行检测。该方法的优势在于，由于生物素是一种小分子蛋白质，一种抗体可以结合多种生物素，而这些生物素也可以结合多种酶联的凝集素，从而可以大大增强显色反应信号。除了使用抗体或蛋白质作为探针来检测特定蛋白质外，有时还可以使用其他探针（例如反复标记的DNA）来检测标记中的DNA结合蛋白。
四，蛋白质印迹实验实验所需试剂
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 纤维素乙酸酯丙酸酯 | LSH78330 | 9004-39-1 | |
| 2 | 标准蛋白质溶液 | HC1785 | ||
| 3 | Ig G | SC0364 | 10047-33-3 | |
| 4 | 碱性磷酸酶 | HC1779 | ||
| 5 | 5-溴-4-氯代二甲苯磷酸（BCIP） | JT7275 | 102185-49-9 | |
| 6 | H2O2 | HCR207671 | 7722-84-1 | |
| 7 | 4-氯苯酚 | JT24020 | 106-48-9 | |
| 8 | 异硫氰酸 | SS4104 | 593-84-0 | |
| 9 | 蛋白内切酶 Glu-C 来源于金黄色葡萄球菌 V8 | SS0249 | 66676-43-5 | |
| 10 | 生物素 DHPE | LSH50144 | 136235-58-0 |
