购物车 
LDH法测定NK细胞活性实验
Release Time：2020-07-15一、LDH法测定NK细胞活性简介
活细胞的胞浆内含有LDH。正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外。LDH 可使乳酸锂脱氢，进而使NAD还原成NADH，后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT 接受H＋被还原成紫红色甲月赞类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。
二、LDH法测定NK细胞活性所需材料
酶标仪、YAC-1细胞、Hank's液（pH7.2～7.4）、RPMI1640完全培养液、乳酸锂或乳酸钠、硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）、NAD、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2）、1%NP40或2.5%Triton
三、LDH法测定NK细胞活性实验步骤
1、LDH基质液的配制
乳酸锂5×10-2mol/L、硝基氯化四氮唑（INT） 6.6×10-4mol/L、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS） 2.8×10-4mol/L、氧化型辅酶Ⅰ（NAD） 1.3×10-3mol/L将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH8.2）
2、靶细胞的传代（YAC-1细胞）
实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。
3、脾细胞悬液的制备（效应细胞）
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，或用Hank's液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mLHank’s液，1000rpm，10min离心，用1mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数（活细胞数应在95%以上），用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。
4、NK细胞活性检测
取靶细胞和效应细胞各100μL（效靶比50：1），加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40或2.5%Triton各100μL；上述各项均设三个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值（OD）。
四、实验注意事项
1、靶细胞和效应细胞必须新鲜，细胞存活率应大于95％。
2、比色时环境温度应保持恒定。
3、LDH基质液应临用前配制。
4、在一定范围内，NK细胞活性与效靶比值成正比。一般效靶比值不应超过100。
五、实验所需试剂清单
| 序号 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | Hanks平衡盐溶液 | HC1153 | ||
| 2 | NP40 | SS6064 | 9016-45-9 | |
| 3 | DL-乳酸锂 | JT20532 | 867-55-0 | |
| 4 | 硝基氯化四氮唑 | |||
| 5 | 吩嗪硫酸甲酯 | SS0315 | 299-11-6 | |
| 6 | Tris-HCl缓冲液 | SS6230 |
