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PCR-SSCP技术实验
Release Time：2020-07-15一、PCR-SSCP实验简介：
PCR-SSCP是由Orita等人于1989年在日本创建的一种用于筛选突变的新技术，它是一种简单，快速且经济的点突变筛选方法。
PCR-SSCP技术的基本原理是将PCR扩增后的DNA片段变性为单链DNA，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳单链DNA时，会形成不同的三维构象，其构象直接影响游泳速度，具有串联长度的DNA的单链的核苷酸序列的至少一部分可以产生立体构象的差异，导致不同的游泳速率和不同的游泳带。
通过PCR扩增的DNA片段被变性成单链，然后在不含变性剂的中性凝胶中进行电泳。与正常情况相比，游泳带的位移可以存在并可以替换。因此，其替换的性质必须是在进行常规的突变筛选手段之前进行PCR-SSCP测试。
二、PCR-SSCP实验所需材料及试剂：
甲酰胺上样缓冲液、非变性聚丙烯酰胺凝胶、TEMED、过硫酸铵、dNTP
三、PCR-SSCP实验步骤
1. PCR反应（同上）
通过琼脂糖电泳确认PCR产物。
2. PCR反应完成后，取5μl扩增产物，加10μl甲酰胺上样缓冲液混合，在98℃变性10分钟，并迅速冰浴。
3.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
（1）准备50 ml的6％非变性聚丙烯酰胺凝胶，添加25μl的TEMED和250μl的10％的过硫酸铵，混合并倒入胶水，然后插入装填梳子。胶完全聚合后，拉出加载梳，安装电泳装置，添加1´TBE电泳缓冲液，该缓冲液应高于样品孔的上边缘，并使用注射器吸收缓冲液冲洗样品孔。
（2）取变性的5μlPCR扩增产物，加到斑点孔中，以20 V / cm运行4?5小时。
（3）拆下电泳装置，取出聚丙烯酰胺凝胶，将其放入塑料皿中，并用蒸馏水冲洗1至2次。
（4）倒入定影液并定影8?10分钟。
（5）用蒸馏水冲洗1至2次；倒入银染液和银染10至12分钟。
（6）用蒸馏水冲洗几次；倒入着色溶液并显色，直到出现清晰的银染为止。
（7）将聚丙烯酰胺凝胶浸入蒸馏水中，观察PCR-SSCP结果。
四、PCR-SSCP实验注意事项：
为了提供更好的观察和分析结果，通常将a-32P dNTP添加到PCR扩增系统中以标记PCR产物，并在电泳后通过放射自显影观察泳带的位置。银染也通常用于在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA泳带染色。该方法可以避免同位素污染和对操作人员的辐射损害，但其灵敏度不如同位素标记。
PCR-SSCP技术的关键在于电泳过程中的各种条件，例如凝胶组成，电泳温度，离子浓度和其他影响分子内相互作用的溶质。
PCR-SSCP的缺陷是假阴性和假阳性的存在，通常，将长度不超过300 bp的待测片段的检测重新插入70％至80％。
五、实验所需试剂清单：
| 1 | TEMED | HC1303 | |
| 2 | 过硫酸铵 | JT10928 |
