购物车 
免疫沉淀（免疫沉淀，IP）实验
Release Time：2020-07-13一、免疫沉淀（免疫沉淀，IP）实验简介：
二、免疫沉淀（免疫沉淀，IP）实验所需材料及试剂：
三、免疫沉淀（免疫沉淀，IP）实验步骤
（1）收获细胞，加入适量的细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），在冰上或4°C下裂解30分钟，以12,000g离心30分钟，取上清液；
（2）取少量裂解液用于蛋白质印迹分析，在细胞裂解液中加入1μg相应抗体和10-50μl蛋白A / G-珠，然后缓慢摇动溶解。
（3）进行免疫沉淀后，在4°C下以3,000 g离心5分钟，将蛋白A / G-珠子离心至试管底部；小心地吸出上清液，并用1ml裂解蛋白A / G-珠子，将缓冲液洗涤3-4次；最后加入15μl2×SDS上样缓冲液，在沸水中煮10分钟。
（4）SDS-PAGE，蛋白质印迹或质谱分析。
四、免疫沉淀（免疫沉淀，IP）实验注意事项：
1.样品处理：
无论免疫沉淀实验成功与否，初始样品处理都是至关重要的。免疫沉淀实验本质上是抗原和抗体之间呈天然构型的反应，样品处理的质量决定了抗原-抗体反应中抗原的质量，浓度以及抗原是否呈天然构型，因此，在先前步骤中以样品作为抗体-琼脂糖珠制备的样品对于免疫沉淀实验的成功至关重要，在这种交替方式中，除了控制试图在冰上或在4°下完成的所有操作外，最关键的是分流液的成分。
RIPA裂解液（主要包含pH 7.4的离子缓冲液，一定接近NaCl的生理浓度），因为免疫沉淀实验的样品通常是原代培养细胞裂解液或细胞系裂解液，洗涤剂和甘油的比例以及蛋白酶抑制剂的类别等）说明了其主要成分的用途，帮助为不同的实验目的和不同的蛋白质特性选择最佳的裂解液之一。
a、缓冲液：离子缓冲液通常在pH7.4下使用Hepes或Tris-Cl。
b、NaCl的浓度通常为150 mM，这主要是因为150 mM接近生理浓度并且不会破坏蛋白质之间的相互作用,细胞内的NaCl浓度不均匀,局部NaCl浓度可低至50 mM, 150 mM NaCl可能会破坏该区域中的蛋白质相互作用,因此，裂解液制剂的最佳NaCl浓度取决于所分析蛋白质的亚细胞定位。
c、由于其粘度，甘油可以为蛋白质之间的相互作用提供良好的保护,通常，添加10％的甘油以稳定蛋白质之间的相互作用。
d、裂解物中的去污剂可以裂解细胞的质膜，还可以破坏许多细胞器的膜，从而释放出许多储存在其中的蛋白酶,由于用于免疫沉淀实验的去污剂相对温和，因此大多数蛋白酶活性得以恢复,蛋白酶的一部分来自细胞质，主要是因为改变了其抑制蛋白或其活性抑制环境以恢复蛋白酶活性,因此，添加蛋白酶抑制剂以防止靶蛋白降解以完成免疫沉淀实验非常重要。通常，金属蛋白酶主要通过添加EDTA来抑制，蛋白酶可以被蛋白酶混合物（多种蛋白酶抑制剂）抑制。
e、清洁剂是免疫沉淀实验，尤其是免疫共沉淀实验的非常关键的因素,不同类型的去污剂和不同去污剂浓度主要通过影响以下因素来影响免疫沉淀作用：
（1）细胞质/膜的通透性：由于许多目的蛋白质都位于细胞器中，因此在抗体与它们反应之前必须释放这些蛋白质。
（2）释放膜蛋白：许多膜蛋白的构型对去污剂的类型和浓度非常敏感，因此，对于这些蛋白质的免疫沉淀实验，必须仔细尝试各种去污剂和不同浓度。
（3）蛋白质相互作用：不同的去污剂对具有不同特性的蛋白质的相互作用具有不同的影响，必须根据特定蛋白质的特性分析和选择去污剂的类型和浓度，现在很难准确预测蛋白质，因此一种更实用的方法是通过特定实验筛选合适的去污剂类型和浓度。
五、实验所需试剂清单：
| 1 | 1.5ml尖底连盖离心管 | F-EP015 | |
| 2 | 2ml圆底连盖离心管(灭菌） | F-EP020-H | |
| 3 | HEPES缓冲液 | HC1113 | |
| 4 | RIPA裂解液 | HC1242 |
