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反向PCR（inverse-PCR）实验
Release Time：2020-07-13一、反向PCR实验介绍：
反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列的一种非常有效的方法之一，在尾部PCR中通常有太多的假阳性，并且反向PCR通常具有特定的条带，其基本上是目标片段。
二、反向PCR（inverse-PCR）实验所需材料及试剂：
三、反向PCR（inverse-PCR）实验步骤
1、a.在T-DNA的边界（左边界和右边界）和限制位点附近设计引物P1和P2；b.回收DNA并与T4连接酶连接以循环消化的DNA片段；C.回收连接的DNA并使用引物P1和P2进行PCR后，可以将其扩展为具有T-DNA插入序列的片段和中间具有侧翼序列的片段。
2、重组核酸内切酶消化：选择适当的重组核酸内切酶，必须将基因组切成一条弥散带，消化之前，应对基因组DNA进行定量，根据T-DNA的左边界序列选择合适的限制性酶切位点EcoRI，BamHI和HindIII / PstI，并在限制性酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后使用这些核酸内切酶消化基因组分别为DNA，消化系统如下：
| EcoRI 缓冲液 | 2μl | ||
| ddH2O | 14.5μl | ||
| EcoRI | 0.5μl（10u/μl） | ||
| 基因组DNA | 3μl | ||
| 20μl |
3.回收DNA
①将消化后的产物倒入1.5ml离心管中，用ddH2O洗涤，换成250μl；
②加入等体积的苯酚和氯仿（V：V = 1：1），涡旋混合均匀，在室温下静置1min；
③以最大速度（13,000 rpm）离心1分钟；
④将上清液转移至另一管中，加入等体积的氯仿，涡旋混合，在室温下静置1min；
⑤以最大速度（13,000 rpm）离心2分钟；
???????四、实验所需试剂清单：
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 1.5ml尖底连盖离心管 | F-EP015 | ||
| 2 | 2ml圆底连盖离心管(灭菌） | F-EP020-H | ||
| 3 | 苯酚 | JT24025 | 108-95-2 |
