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逆转录实验（RT,实验简介,所需材料,操作步骤）
Release Time：2020-07-10一、逆转录（RT）实验简介：
逆转录也经常称为“反转录”,是某些生物(如鸡的肉瘤病毒、HIV等)的特殊复制方式。它们的遗传信息載体是RNA而不是DNA.因此,在感染细胞时,首先经过逆转录作用成为双链DA,才能整合到宿主基因组中去这个过程由逆转录酶催化,它具有以RNA为模板合成DNA逆转录现象和逆转录酶是分子生物学研究中的重大发现,是对经典中心法则重要补充。
二、逆转录（RT）实验所需的材料
（1）移液枪：200ul，10ul
（2）吸头：200ul，20ul
（3）EP管：1.5ml，100ul
（4）水浴箱
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 10ul白吸头(灭菌) | FT-10-H | ||
| 2 | 200ul黄吸头（灭菌 | FT-200-H | ||
| 3 | 1000ul蓝吸头（灭菌） | FT-1000-H | ||
| 4 | 1.5ml尖底连盖高速离心管（灭菌） | F-EP015-H |
三、逆转录（RT）操作步骤
1.实验前准备
（1）将塑料产品在1‰DEPC水（如果需要，使用移液器插入DEPC水）中一一浸泡在37℃下过夜，然后高压送3次，然后在80℃的烤箱中干燥（或放入37℃）在℃下干燥约8小时。在测试前将移液器吸头的尖端放好。
（2）DEPC水：用于浸泡实验设备的DEPC水的制备：将1000ml的双蒸馏水加1ml DEPC，放入1000ml的容量瓶中，静置4小时后使用。制备用于逆转录的DEPC水：将100ml盐水瓶装满40ml双蒸馏水，加入40ul DEPC，37°C过夜，送至高压，然后分成几个1.5ml EP管，在-20°C下保存以后使用。
（3）RT中需要的各种试剂
（4）引物浓度的计算方法：（新合成引物的稀释度）如果最终浓度为XuM（pmol / ul）加DEPC水体积（ul）=（OD×33×1000000）/（分子量×X）
（注）为避免RNase污染，在RT期间仍应戴一次性手套和口罩。
2. RT步骤
（1）RT与SSⅢ逆转录酶（20ul体积）
①准备0，65ml EP管②在冰上操作：在EP管中加入10ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，并短暂离心。③在65℃水浴中放置5分钟后，立即在0℃冰水浴中放置至少1分钟。④短时间离心后，在冰上操作：加入4ul5×First-StrandBuffer，1ul0.1MDTT，1ulRNAse抑制剂，1ulSSⅢ逆转录酶。⑤短暂离心⑥在50°C水浴中进行60分钟逆转录。⑥在70°C水浴中15分钟进行逆转录酶灭活⑦储存在-20℃，或立即进行PCR。
（2）RT与AMV逆转录酶（10ul体积）
①准备0.65ml EP管②加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA③稍微离心，在100℃的开水中离心1分钟④添加0.5uldNTP，2ul5×Buffer，1ulAMV逆转录酶⑤稍微离心，用密封膜密封，使用42℃水浴和90℃作为室温⑥100℃开水3分钟使AMV失活⑦立即PCR或在-20℃下保存。
