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小鼠胚胎干细胞培养实验
Release Time：2020-07-10一、实验简介：
普通培养的胚胎干细胞处于未分化状态，采用培养基培养、细胞恢复、冷冻保存细胞、明胶包被、细胞传代方法。
二、实验材料：
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 1.5ml尖底连盖离心管 | F-EP015 | ||
| 2 | 2ml圆底连盖离心管(灭菌） | F-EP020-H | ||
| 3 | L-谷氨酰胺 | HCM75471 | ||
| 4 | 90mm*15mm 塑料培养皿(灭菌） | FM-90-X | ||
| 5 | 90mm*20mm 塑料培养皿(灭菌） | FM-90-G | ||
| 6 | 10*10cm方形塑料培养皿(灭菌） | FM-100-F | ||
| 7 | β-巯基乙醇 | JT27316 |
三、操作步骤：
<1>.体外分化方法
（注）：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol。
1.从液氮中取出一管细胞；
2.将冷冻保存管置于37°C水浴中2分钟（或管中的溶液完全溶解）；
3.将细胞转移到15ml Falcon管中；
4、加入5ml ES中（用中冲洗冻存管）；
5.离心3分钟；
6、弃上清，用2ml ES中重悬细胞，至少吹打10次；
7、种在明胶涂料（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
8.孵化。
<2>.冷冻保存细胞
（注）冷冻溶液：90％HS和10％DMSO
1.用1×PBS洗涤细胞，并在培养皿中留少量PBS；
2.用细胞刮刀收集细胞；
3.将细胞转移到15ml离心管中，离心3分钟；
4.弃去上清液，将细胞重悬于冷的冷冻保存溶液中（10cm培养皿用2ml，15cm培养皿用6-7ml）。
5.分别装入冷冻管中，每管1ml；
6.设定在-80°C过夜，第二天移入液氮中。
<3>.明胶涂料
（注）准备500ml 0.1％明胶溶液
1.将0.5 g明胶溶解在500 ml无钙镁的PBS中（在50-65°C水浴15-30分钟）。
2.最好在不冷却溶液的情况下通过0.22μm的滤膜过滤，并保存在4°C下。
<4>.涂层培养板或培养皿
1.加入足够的明胶溶液覆盖培养表面（15 cm培养皿加2 ml，10 cm培养皿加0.5?1 ml，溶液的量并不重要，只要它能完全覆盖培养表面即可）；
2.在室温下放置30分钟；
3.取出明胶溶液，并将培养板在室温下包装在包装袋中。最好将培养皿平放或倒置放置，以防止明胶污染培养皿盖并流出培养皿。
<5>.细胞遗传
建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶涂料的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞，纯化步骤：
1.除去培养液；
2.不用钙和镁的PBS（Gibco）洗涤；
3.添加胰酶EDTA（Gibco）。在37°C下孵育5分钟。
4、加入ES中使胰酶失活；
5.将细胞转移到15 ml离心管中，离心3分钟；
6、去除上清，将细胞重悬于2 ml ES中，至少吹打10－20次。如果加入中的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。 ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。
7.在未包被的组织培养皿中接种细胞（使用与开始时相同的标准培养皿），并将其放入培养箱中2小时（分化的细胞将在此时间内粘附，而ES细胞将保持悬浮状态）；
8、含有细胞的中转入geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）
9.建议传递1：4到1:10的比例（ATCC）
<6>.体外分化
胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的中内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
<7>.包被：
1.加入聚-L-赖氨酸至少2-3小时（也可以过夜）
2.抽吸聚-L-赖氨酸
3.加入纤维结合蛋白，约1-2小时
4.吸出纤维结合蛋白，使其干燥30分钟
5.储存于4℃
（注）24孔板使用200μl，6孔板使用500μl。摇动培养板，以确保溶液可以覆盖盖玻片或培养良好。有时需要大力摇动盘子。
