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测定植物中硝酸还原酶的活性（离体法）
Release Time：2020-07-10一、实验原理：
硝酸还原酶（NR）是植物氮同化的关键酶，可催化植物中硝酸盐还原为亚硝酸盐：
生成的亚硝酸盐和对氨基苯磺酸（或对氨基苯磺酰胺）和α-萘胺（或萘乙二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。反应如下：
所得的红色偶氮化合物在540nm的波长处具有最大吸收峰，其可以通过分光光度法确定。硝酸还原酶活性可以由产生的亚硝酸氮的量表示。通常，单位为Nμg·g ﹣1·h ﹣1。 NR的测定可分为体内法和体外法。体内方法步骤简单，适用于快速，多组测定。体外方法很复杂，但重复性好。
二、实验所需仪器仪表：
离心机分光光度计冰箱;砂浆;试管和其他器具的使用方法与居住方法相同。
三、实验所需的试剂：
0.1mol / L磷酸盐缓冲液pH7.5; 0.1mol / L KNO 3磷酸盐缓冲液； 1％（W / V）对氨基苯磺酸溶液; 0.2％（W / V）α-萘胺溶液（上述溶液制备方法与体内方法相同）。
NADH 2溶液：在1ml 0.1mol / L磷酸盐缓冲溶液中称取2.0mg NADH 2（冰箱可使用一周）；
提取缓冲液（25mmol / L磷酸盐缓冲液，5mmol / L半胱氨酸，5mmol / L EDTA-Na 2混合物）：取250ml 0.1mol / L磷酸盐缓冲液，加入半胱氨酸0.61g; EDTA -1.86 g Na 2溶解后，用KOH溶液将pH值调节至7.5，并将体积设定为1000 ml。
| 序号 | 产品 | CAS号 | 货号 | 备注 |
| 1 | 磷酸盐缓冲液pH7.5 | HC2048 | ||
| 2 | 对氨基苯磺酸溶液 | 121-57-3 | JQ0022 | |
| 3 | α-萘胺溶液 | 552-46-5 | JT8708 | |
| 4 | L半胱氨酸 | 52-90-4 | SS3295 | |
| 5 | L磷酸盐缓冲液 | |||
| 6 | KOH溶液 | 1310-58-3 | JT0012 |
四、实验方法：
1.取2克材料，洗涤并切碎，放入研钵中，然后放入低温冰箱中冷冻30分钟。取出并在冰浴中添加少量石英砂和提取缓冲液（每克鲜重分别以1ml，2ml和4ml两次添加玉米，小麦和大米）。研磨成匀浆，在低温下离心5分钟（4000r / min）。上清液是粗酶提取物。以上操作应尽可能在冰浴中进行。
2.将0.4ml粗酶提取物，1.2ml 0.1mol / L KNO 3磷酸盐缓冲液，0.4ml NADH2溶液倒入准备好的带刻度的试管中，并充分混合，在30℃孵育30分钟，不添加NADH 2。对照，取0.4ml蒸馏水代替。
3.孵育后，立即添加1 ml对氨基苯磺酸溶液以终止反应，添加1 mlα-萘胺溶液，显色20分钟，在台式离心机上离心10分钟，然后测量上清液在分光光度计上在540 nm波长处。
4.标准曲线制作和结果计算与体内方法相同。
五、实验预防措施：
1.硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防止亚硝酸盐还原为氨。添加异丙醇可以增加组织对NO 3－和NO 2－的渗透性。厌氧条件可以防止氧气竞争还原吡啶核苷酸。
2.采样前，材料应照明3h以上。现场采样应在上午9点之后进行，并且不应在雨天进行。采样位置应尽可能一致。
3.配制的KNO 3磷酸盐缓冲溶液应密闭保存，否则容易繁殖的微生物会减少NO 3－，从而使对照的吸收率更高。
4.从显色到颜色比较的时间必须一致，太短或太长都会影响颜色。
