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SDS-PAGE凝胶电泳凝胶的制备方法
Release Time：2020-07-10一、实验基本介绍：
SDS-PAGE电泳可用于分离蛋白质和核苷酸。这里是对SDS-PAGE实验原理，试剂和设备以及实验程序的综述。
二.实验原理：
SDS-PAGE是一种经济，快速，可重复的定量，比较和表征蛋白质的方法。该方法基于混合蛋白质的不同分子量。
SDS是一种洗涤剂，可以与蛋白质的疏水部分结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于均匀溶液中。 SDS蛋白复合物的长度与其分子量成正比。向样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因子可以忽略不计。蛋白质亚基的迁移率取决于该亚基的分子量。
三.试剂和设备：
| 序号 | 名称 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | Tris-HCl(pH6.8) | HC2104 | ||
| 2 | 甘油 | JT26018 | 56-81-5 | |
| 3 | 巯基乙醇 | SS0504 | 60-24-2 | |
| 4 | 溴酚蓝 | SX0029 | 115-39-9 | |
| 5 | 丙烯酰胺 | LSH54449 | 79-06-1 | |
| 6 | 甲叉双丙烯酰胺 | SF0004 | 110-26-9 | |
| 7 | 四乙基乙二胺 | JT10222 | 150-77-6 | |
| 8 | 过硫酸铵 | JT10928 | 7727-54-0 | |
| 9 | 甘氨酸 | SS3763 | 56-40-6 |
实验试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）：0.6ml 1mol / L Tris-HCl（pH6.8），5ml 50％甘油，2ml 10％SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1％溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。它可以在4°C下保存数周或在-20°C下保存数月。
2.凝胶存储溶液：在通风橱中，称取30克丙烯酰胺和0.8克亚甲基双丙烯酰胺。加入蒸馏水溶解后，使体积达到100ml。过滤后，放入棕色瓶中，在4℃下保存，一般可保存1个月。
3. pH8.9分离凝胶缓冲液：Tris 36.3g，加1mol / L HCl 48ml，加蒸馏水80ml溶解，调节pH 8.9，定容至100ml，在4℃下保存。
4. pH6.7浓缩凝胶缓冲液：Tris 5.98g，加1mol / L HCl 48ml，加蒸馏水80ml溶解，调节pH 6.7，定容至100ml，在4℃下保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液
6.10％过硫酸铵（用双蒸馏水新鲜制备）
7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取6.0g Tris，28.8g甘氨酸，加入约900ml蒸馏水，将pH值调节至8.3，然后用蒸馏水将体积调至1000ml。使用前应在4°C储存并稀释10次。
8.考马斯亮蓝G250染色液：称取100毫克考马斯亮蓝G250，将其溶于200毫升蒸馏水中，缓慢加入7.5毫升的70％高氯酸，最后加水至250毫升，搅拌1次。小时，并用小孔滤纸过滤。
设备：电泳仪，电泳槽，水浴，摇床。
四.实验操作；
1.样品制备：
在eppendorf管中将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul + 5ul）混合。放入100℃加热5-10min，取上清液点样。
2.分离凝胶和浓缩凝胶的制备：
①用清洁剂清洗玻璃板，样品梳子和垫片，用ddH2O冲洗几次，然后用乙醇擦拭并干燥；
②在两块清洗过的玻璃板之间加垫片，并按照Bio-Rad MiniⅡ/Ⅲ的说明进行安装。
③根据以下体积准备8.0 ml的10％分离凝胶，并充分混合：ddH2O 3.0 ml； 1.0 mol / LTris-HCl pH = 8.8 2.1毫升; 30％Acr-Bis 2.8毫升10％SDS 80 ul; 10％AP 56 ul； TEMED 6 ul。
④将分离胶倒入玻璃板之间，立即用一层蒸馏水覆盖，约20分钟后胶会聚合；
⑤准备以下体积的3.0 ml 6％浓缩凝胶，并充分混合：ddH2O 1.0 mol / LTris-HCl pH = 6.8 30％Acr-Bis; 2.0毫升400 ul 600 ul; 10％SDS 10％AP TEMED; 36ul 24ul 4ul。
⑥从上层倒出蒸馏水，干燥滤纸，倒入浓缩胶，插入样品梳；
⑦安装电泳系统，加入电极缓冲液并加样20μl；
⑧电压稳定在200V，当溴酚蓝刚从分离凝胶中用完时，停止电泳，大约需要45分钟?1小时。
⑨取下橡胶片，将剥离胶放入染色液中，在室温下染色1至2小时；加入脱色溶液，将其以80 rpm的速度放在脱色振荡器上，然后更换脱色溶液（10 ml冰醋酸； 45 ml乙醇； 45 ml蒸馏水），直至完全除去。
聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛作用。可以根据蛋白质亚基的不同分子量来分离蛋白质。 SDS-PAGE电泳凝胶的质量直接关系到电泳的成功。一般浓度凝胶和分离凝胶的pH分别为6.7和8.9。
