购物车 
琼脂糖凝胶电泳实验
Release Time：2020-07-06琼脂糖凝胶电泳实验
一、实验方法原理
使用琼脂糖作为支持介质的电泳方法。分析原理与其他支持电泳法之间的主要区别在于，它具有“分子筛”和“电泳”的双重功能。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，而大分子物质在喘振时会受到大阻力，因此在凝胶电泳中，带电粒子的分离不仅取决于性质和数量净电荷的多少，还取决于分子的大小，从而大大提高了分辨率。然而，由于其相对较大的孔径，分子筛作用对于大多数蛋白质而言可以忽略不计，并且现在已广泛用于核酸研究中。
蛋白质和核酸根据不同的pH值将具有不同的电荷，并且电场中的力将不同，因此运行速度也不同。根据此原理，可以将它们分开。电泳缓冲液的pH在6和9之间，离子强度在0.02和0.05之间。 1％琼脂糖通常用作电泳的载体。琼脂糖凝胶可以区分大约100 bp的DNA片段。尽管其分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶的分辨率，但它易于制备且分离范围广。普通的琼脂糖凝胶可以分离0.2-20 kb的DNA。使用脉冲电泳，可以分离高达107 bp的DNA片段。
在琼脂糖凝胶中游泳时，DNA分子具有电荷作用和分子筛作用。 DNA分子在等电点以上的pH溶液中带负电荷，并在电场中向正极移动。由于糖-磷酸主链的重复结构，相同量的双链DNA几乎具有相同量的净电荷，因此它们可以相同的速率移向正极。
二、实验材料：DNA
三、试剂盒、试剂
琼脂糖、TBE电泳缓冲液电泳上样缓冲液、溴化乙锭（EB）溶液母液DNAGreen
四、仪器，耗材
卧式电泳仪，电泳仪，台式高速离心机，恒温水浴，微型移液枪，微波炉或电炉，紫外线透射仪，照片支架，相机及配件
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS号 | 备注 |
| 1 | Tris-Hcl | HC2055 | ||
| 2 | EDTA | WSH44880 | 65501-24-8 | |
| 3 | NaOH | JT8650 | 1310-73-2 | |
| 4 | SDS | SS0013 | 151-21-3 | |
| 5 | NaAc | TDZ001793 | 132302-25-1 | |
| 6 | 异丙醇 | JSH64785 | 453-11-2 | |
| 7 | 溶菌酶 | YZM000117 | 9001-63-2 | |
| 8 | 无水乙醇 | JT26000 | 64-17-5 | |
| 9 | LB培养基 | HC1007 | ||
| 10 | FT-1000 | 1000ul蓝吸头1000ul Pipet Tips | ||
| 11 | FT-200 | 200ul黄吸头 | ||
| 12 | F-EP020 | 2ml圆底连盖离心 |
五、实验程序
5xTBE缓冲液：450 mmol / L三硼酸，10 mmol / L EDTA，pH 8.0。使用时，将上述存储溶液稀释至0.5倍TBE缓冲溶液10倍，可同时用作电泳和凝胶制备的缓冲溶液。
2. 制胶
（1）根据凝胶量和凝胶浓度，向琼脂糖瓶中加入一定量的电泳缓冲液（琼脂糖粉的总液体量不得超过锥形瓶容量的50％）。
（2）用保鲜膜或牛皮纸盖住锥形瓶的嘴，在膜或纸上打一些小孔，然后在微波中加热并溶解琼脂糖。加热时，当溶液沸腾时，戴上耐热手套并小心地摇动锥形瓶，以充分均匀地溶解琼脂糖。重复该操作几次，直到琼脂糖完全溶解。
（3）让溶液冷却至约50°C-60°C。如有必要，添加溴化乙锭溶液（终浓度为0.5μg/ ml）或以1μL/ 30 mL的比例添加DNAgreen染料，并充分混合。
（4）将琼脂糖溶液倒入橡胶模具中，然后将梳子插入适当的位置。凝胶的厚度通常在3至5mm之间。上胶模具如下图所示。对于小胶水，倒入约25-30 mL的琼脂糖溶液，对于大胶水，倒入约60-70 mL。如果需要切割和回收凝胶，可以适当地增稠凝胶。
（5）让胶水在室温下凝固约30分钟至1小时。
3.上样
a.将适量的样品与6x上样缓冲液混合（例如：1μl样品和5μl6x上样缓冲液），然后用微量移液器小心地将其添加到样品孔中。
b.可根据样品浓度调节样品量。如果DNA含量低，则可以按照上述比例增加样品量，但总体积不得超过样品罐的容量（小孔通常为40μl，大孔通常为200μl上限取决于粘合膜的规格。
c.添加每个样品后，请更换移液器吸头，以防止相互污染。装入样品时要小心，以免损坏凝胶或刺穿样品罐底部的凝胶。
4.电泳
（1）添加样品后，关闭电泳槽盖并立即打开电源。控制电压保持在110 V，电流大于40 mA。
（2）当条带移离凝胶前端约2 cm（约40分钟）时，停止电泳。
（3）拍照并在紫外线下观察。
六、预防措施
1. 5×TBE缓冲液沉淀时间过长，因此请勿一次混合太多。电泳电泳缓冲液为0.5×TBE缓冲液，用5×TBE缓冲液原液稀释后即可使用。
2. 用于电泳的缓冲液和用于凝胶制备的缓冲液必须统一。
3.琼脂糖粉不应在微波炉中加热太长时间，当溶液起泡沸腾时，请停止加热，否则会导致溶液过热和爆沸，导致琼脂糖凝胶浓度不准确并损坏微波炉。溶解琼脂糖时，必须确保琼脂糖完全溶解，否则电泳图像会模糊。
4. 如果不立即使用凝胶，请用保鲜膜将其包裹，并在4℃下保存，一般可以保存2至5天。
