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考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的实验
Release Time：2020-07-06考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的实验
一、实验简介
蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。
二、实验原理
考马斯亮蓝法为一种快速，灵敏的方法，利用蛋白质染料结合原理定量测定痕量蛋白质。与其他几种方法相比，这种蛋白质测定法具有突出的优势，因此被广泛使用。该方法是目前最敏感的蛋白质检测方法。
考马斯亮蓝G-250染料与酸性溶液中的蛋白质结合，将染料的最大吸收峰的位置从465 nm更改为595 nm，溶液的颜色也从棕黑色变为了蓝色。通过测量595 nm处光吸收的增加，可以知道与其结合的蛋白质的量。检测发现染料主要与碱性蛋白质有关氨基酸（特别是精氨酸）与芳香族氨基酸残基结合。
三、考马斯亮蓝染色法的突出优点
（1）灵敏度高，估计约为Lowry方法的四倍，他的最低蛋白质检测量达到1 mg。这是因为蛋白质和染料的组合所产生的颜色变化很大，并且蛋白质-染料复合物具有更高的消光系数，因此光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry方法大得多。
（2）测量快速简便，只需添加一个试剂。只需约5分钟即可完成样品的测定。由于染料和蛋白质结合的过程，只需约2分钟即可完成，其颜色可在1小时内保持稳定，并且颜色稳定性在5分钟至20分钟之间最佳。因此，不需要像Lowry方法那样耗时且严格的时间控制。
（3）干扰物质少。例如Tris缓冲液，糖和蔗糖，甘油，巯基乙醇，它们会干扰Lowry方法EDTA等等，请勿干扰此分析。
四、这种方法的缺点
（1）由于各种蛋白质中精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，考马斯亮蓝染色法在测定不同蛋白质时存在较大偏差。绘制标准曲线时，通常将g-球蛋白用作标准蛋白以减少这种偏差。
（2）仍然有一些物质干扰此方法的确定。主要干扰物质为：洗涤剂，Triton X-100，十二烷基硫酸钠（SDS）等待。
五、试剂和设备
1.试剂
考马斯亮蓝试剂：
将考马斯亮蓝G-250溶解于50 mL的95％乙醇中，加入100 mL的85％磷酸，并用蒸馏水稀释至1000 mL。
2.要测试的标准液和蛋白质溶液
a.标准蛋白质溶液
水晶牛血清对于蛋白质，请事先通过微量凯氏定氮法测定蛋白质氮含量，并根据其纯度用0.15 mol / L NaCl制备1 mg / mL蛋白质溶液。
b.要测试的蛋白质溶液。
人血清，使用前用0.15 mol / L NaCl稀释200倍。
c.设备
试管1.5×15 cm（×6），试管架，移液管0.5 mL（×2）; 1毫升（×2）; 5毫升（×1）;恒温水浴;分光光度计。
六、操作方法
1、制作标准曲线
取7支试管，按下表平行操作。
绘制标准曲线：以A595 nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
2、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595 nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
七、注意事项
在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。
一、实验简介
蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。
二、实验原理
考马斯亮蓝法为一种快速，灵敏的方法，利用蛋白质染料结合原理定量测定痕量蛋白质。与其他几种方法相比，这种蛋白质测定法具有突出的优势，因此被广泛使用。该方法是目前最敏感的蛋白质检测方法。
考马斯亮蓝G-250染料与酸性溶液中的蛋白质结合，将染料的最大吸收峰的位置从465 nm更改为595 nm，溶液的颜色也从棕黑色变为了蓝色。通过测量595 nm处光吸收的增加，可以知道与其结合的蛋白质的量。检测发现染料主要与碱性蛋白质有关氨基酸（特别是精氨酸）与芳香族氨基酸残基结合。
三、考马斯亮蓝染色法的突出优点
（1）灵敏度高，估计约为Lowry方法的四倍，他的最低蛋白质检测量达到1 mg。这是因为蛋白质和染料的组合所产生的颜色变化很大，并且蛋白质-染料复合物具有更高的消光系数，因此光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry方法大得多。
（2）测量快速简便，只需添加一个试剂。只需约5分钟即可完成样品的测定。由于染料和蛋白质结合的过程，只需约2分钟即可完成，其颜色可在1小时内保持稳定，并且颜色稳定性在5分钟至20分钟之间最佳。因此，不需要像Lowry方法那样耗时且严格的时间控制。
（3）干扰物质少。例如Tris缓冲液，糖和蔗糖，甘油，巯基乙醇，它们会干扰Lowry方法EDTA等等，请勿干扰此分析。
四、这种方法的缺点
（1）由于各种蛋白质中精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，考马斯亮蓝染色法在测定不同蛋白质时存在较大偏差。绘制标准曲线时，通常将g-球蛋白用作标准蛋白以减少这种偏差。
（2）仍然有一些物质干扰此方法的确定。主要干扰物质为：洗涤剂，Triton X-100，十二烷基硫酸钠（SDS）等待。
五、试剂和设备
1.试剂
考马斯亮蓝试剂：
将考马斯亮蓝G-250溶解于50 mL的95％乙醇中，加入100 mL的85％磷酸，并用蒸馏水稀释至1000 mL。
2.要测试的标准液和蛋白质溶液
a.标准蛋白质溶液
水晶牛血清对于蛋白质，请事先通过微量凯氏定氮法测定蛋白质氮含量，并根据其纯度用0.15 mol / L NaCl制备1 mg / mL蛋白质溶液。
b.要测试的蛋白质溶液。
人血清，使用前用0.15 mol / L NaCl稀释200倍。
c.设备
试管1.5×15 cm（×6），试管架，移液管0.5 mL（×2）; 1毫升（×2）; 5毫升（×1）;恒温水浴;分光光度计。
| 序列 | 产品名称 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 乙醇 | JT26000 | 64-17-5 | |
| 2 | 磷酸 | JT11391 | 7664-38-2 | |
| 3 | 氯化钠 | JT0001 | 7647-14-5 |
六、操作方法
1、制作标准曲线
取7支试管，按下表平行操作。
| 试管编号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 标准蛋白溶液（mL） | 0 | 0.01 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 |
| 0.15mol/LNaCl（mL） | 0.1 | 0.09 | 0.08 | 0.07 | 0.06 | 0.05 | 0.04 |
| 考马斯亮蓝试剂 | 5 mL | ||||||
| 摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595 nm处比色 | |||||||
2、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595 nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
七、注意事项
在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。
