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免疫荧光（Immunofluorescence, IF）(实验方法,简介,实验步骤,实验所需试剂)
Release Time：2020-07-06免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法
一．免疫荧光实验简单介绍
免疫荧光技术正在免疫学,生物化学与显微镜以技术为基础的技术。它基于抗原抗体反应的原理是先用荧光团标记已知的抗原或抗体，然后使用该荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质与定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）含量测定。
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备,固定及通透（或称为透化）,封闭,抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定与通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂与固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭与抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理,固定,封闭,抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
二.免疫荧光实验步骤：
（1）细胞制备。对于单层生长细胞，在传代中培养事先将细胞接种到带有处理过的盖玻片的培养皿中时，在细胞长成单层后除去盖玻片，并用PBS洗涤两次;对于悬浮的生长细胞，取对数生长细胞，并使用PBS离心（1000rpm，5min）洗涤两次，使用细胞离心片机制备细胞碎片或直接制备细胞涂片。
（2）固定的。根据需要选择合适的固定剂来固定细胞。固定的细胞可以在含有叠氮化钠的PBS中于4°C保存3个月。在PBS中洗涤3×5分钟。
（3）透明。在添加抗体进行孵育之前，通常需要先渗透用交联剂（如多聚甲醛）固定的细胞，以确保抗体可以到达抗原位点。渗透剂的选择应充分考虑抗原蛋白的性质。渗透时间通常为5-15分钟。渗透后，用PBS洗涤3×5分钟。
（4）封闭。使用封闭液封闭细胞，时间一般为30min。
（5）一抗的组合。在室温下孵育1h或在4°C过夜。用PBST冲洗3次，每次冲洗5分钟。
（6）二抗结合。间接免疫荧光法需要使用二抗。在黑暗中于室温下孵育1小时。用PBST冲洗3次，每次冲洗后用蒸馏水冲洗5分钟。
（7）密封测试。加入一滴密封的片剂，装入片剂，并用荧光显微镜检查。
三．免疫荧光实验所需试剂
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | PBS | HC2031 | ||
| 2 | PBST | HC0757 | ||
| 3 | 多聚甲醛 | JT12020 | 30525-89-4 |
四．免疫荧光实验步骤：
（1）细胞准备
用于免疫荧光实验的细胞可以是直接在盖玻片上生长的贴壁细胞，也可以是离心后被涂片的悬浮细胞，或者是通过离心从人体获得的组织细胞悬浮液而被涂片的悬浮细胞。具有良好粘附性的细胞通常在培养过程中直接置于盖玻片中，以使细胞在其上生长。尽量避免将粘附性能差的细胞用于免疫荧光实验，以免引起随后的脱落操作而导致细胞脱落。一些实验需要使用这种细胞或悬浮细胞进行免疫荧光观察。建议使用细胞离心片机制备细胞碎片或直接制备细胞涂片。
（2）固定与通透
研究细胞表面抗原或不稳定的抗原可以不固定，一般应固定。有三个固定目的：
①防止细胞从载玻片上脱落;
②清除阻碍抗原抗体混合脂质;
③使标本易于保存。
样品的固定原理是：
①不能破坏细胞内的抗原;
②不能凝集蛋白;
③应保持细胞与亚细胞结构;
④固定后应保持通透性，以确保抗体可以自由进入所有细胞，并且亚细胞成分与抗原结合。
常用的固定剂有多种，应根据所研究抗原的性质与所使用的抗体特性选择适当的固定剂。通常固定方法可以分为两类：有机溶剂与交联剂。有机溶剂如甲醇与丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸该基团形成了一个分子间桥，形成了抗原相互连接的网络结构。交联剂比有机溶剂更易于维持细胞结构，但由于交联会阻碍抗体结合，因此可能会降低某些细胞成分的抗原性，因此需要一个渗透步骤以使抗体进入样品。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白作为抗原产生的抗体可能在免疫荧光方面更有效。
最常用的固定剂有多聚甲醛与甲醇，少数情况也使用乙醇，丙酮及戊二醛等进行固定。通常，细胞结构抗原,病毒及一些酶类抗原使用丙酮,乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好的结果，而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。细胞器与细胞颗粒内的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。
通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要，因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白。但是，如果待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同样需要对细胞进行通透。相反，如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，则不需要进行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作为固定剂时是不需要通透的。甲醇同样具有通透作用，但有些场合并不适合用甲醇，因为一些表位对甲醇非常敏感。常用的通透剂是去垢剂，如Triton ,NP-40,以及Tween 20, Saponin, Digitonin 与 Leucoperm等。Triton与NP-40属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常适合核抗原检测。但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作用时间过长，它们将破坏蛋白，从而影响实验结果。Triton X-100是最常用的通透剂，但是它将破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜相关抗原。后面一组去垢剂要温与得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固定，这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白，从而大大减少了免疫荧光的背景与非特异性信号。固定后以冷PBS液漂洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
（3）封闭
封闭的目的是减少抗体非特异性结合，最常用的封闭剂是1％BSA，PBS pH 7.5，其他替代性封闭剂是1％明胶，1％牛或与第二抗体种类相同血清（3-10％）等
（4）抗体孵育
直接免疫荧光法中的一抗与间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光。此外，为保证结合质量与防止干燥抗体孵育应尽可能在湿箱中进行。
（5）安装和荧光观察
标记好荧光的细胞片原则上可以直接进行观察，特别是有时候封片不当反而使得前功尽弃。但在绝大多数情况下，为了保存结果，以便进一步观察,照像,统计分析等，需要密封。常规方法是使用甘油或中性树脂进行密封，为提高密封效果，经常需要在密封过程中添加特殊的抗荧光淬灭剂。
（6）标本保存
由于荧光色素与蛋白分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度与特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。由于性能良好的抗荧光淬灭剂的出现，荧光标记的标本可以在低温（4℃或-20℃）下保存相当长的时间。在某些情形下，考虑到实验的成本及实验条件，也可以采取权宜的办法，比如固定标本片后低温保存，在需要时再进行荧光标记，即随用随染。
