购物车 
噬菌体的检测与效价测定
Release Time：2020-07-06一、噬菌体的检测与效价测定实验简单介绍：
1. 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
2. 学会检查噬菌体的方法。
3. 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
二、实验目的
- 目的：探讨该方法的临床效果了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
2、学习如何检查噬菌体。
三、实验原则：
噬菌体是一种特别寄生于细菌和放线菌上的病毒。它的个体形状很小，用常规的微生物计数法无法测定其数量。当强毒噬菌体感染细菌时，会使敏感菌迅速裂解并释放大量的子代噬菌体，进而扩散感染周围细胞。最后，含有敏感菌的悬浮液会逐渐变得清澈，或者在含有敏感菌的平板上出现肉眼可见的菌斑。了解噬菌体的特性，快速检测、分离和测定噬菌体效价具有重要意义。
样品可以是发酵液、空气、污水、土壤等（对于不能取样但需要检验的对象，可以用用无菌水浸泡过的棉花表面作为检验样品）。为了便于分离，可通过增殖培养提高样品中噬菌体的数量。
用生物检测法检测噬菌体需要12小时左右，无法及时判断是否存在噬菌体污染。噬菌体污染可以通过快速检测大致确定，以便采取必要的预防措施。正常发酵（培养）液离心后沉淀，上清液蛋白质含量很小，加热后仍清晰可见；而离心后感染噬菌体的发酵（培养）液上清液中含有从热解菌中逸出的活性蛋白，但加热后蛋白质变性，有丁达尔效应，光照下不明显。该方法简便、快速、准确，可用于鉴定发酵液污染的噬菌体。但是，它不适用于致溶性细菌和嗜热噬菌体的诊断，也不适用于噬菌体感染较少的原代种子培养基。
噬菌体效价为1ml样品中感染性噬菌体粒子数。用双琼脂平板法测定效价。由于一个噬菌体通常在含有特定宿主菌的琼脂平板上产生一个噬菌体斑，因此噬菌体的效价可以根据一定体积的噬菌体培养基中的菌斑数量来计算。该方法形成的斑块形态大小一致，清晰度高，计数更准确，应用广泛。
四、实验所需材料：
| 序号 | 产品 | CAS号 | 货号 | 备注 |
| 1 | 大肠杆菌噬菌体MS2液体培养基 | PYJH50758 | ||
| 2 | 大肠杆菌噬菌体MS2液体培养基 | PYJH50758 | ||
| 3 | 牛肉膏蛋白胨培养基 | SS0628 | ||
| 4 | 90*15mm培养皿 | FM-90-X | ||
| 5 | 胰蛋白胨水培养基 | PYJH51867 |
1应变：
敏感指示菌（E.coli）和噬菌体（从下水道或化粪池污水中分离）。
2介质：
两次肉浸膏蛋白胨培养基，上层肉浸膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含0.7%琼脂，试管分为ml），下层肉浸膏蛋白胨固体琼脂培养基（含2%琼脂）和1%蛋白胨水培养基。
3、仪器仪表：
无菌试管、培养皿、烧瓶、移液管（1,5ml）、恒温水浴锅、离心机、721分光光度计等。
五、实验流程：
1、噬菌体检查
2、噬菌体效价测定
六、实验方法：
1噬菌体检查：
① 样品收集
将2-3g土样或5ml水样（如下水道污水）放入灭菌三角瓶中，对数生长期加入3-5ml敏感指示菌（大肠杆菌），然后加入20ml肉汤蛋白胨培养基。
② 增殖培养
噬菌体在30℃培养12～18h。
③ 离心分离
培养基以3000rpm离心15-20min，上清液用pH7.0和1%蛋白胨水稀释至10-2-10-3，进行噬菌体检测和效价测定。
④ 采用生物测定法
采用双琼脂平板法；
倒入下层琼脂，融化下层培养基，倒入平板（约10ml/板）备用。
顶部琼脂
融化上层培养基。待融化的上层培养基冷却至约50℃时，每管加入敏感指示菌（E.coli）菌液0.2ml，待测样品液或上述噬菌体增殖液0.2-0.5ml，混匀后，立即倒入上板中，使其光滑。
恒温培养：30℃培养6～12h。
观察结果：如果有噬菌体，双层培养基上层出现透明的无菌圆形菌斑。
单层琼脂平板法
去掉下层培养基，上层培养基琼脂含量增加到2%，融化后冷却至45℃左右。加入指示菌和供试品作为上层方法，混匀后迅速倒出。30℃孵育6～16h后观察结果。
⑤ 离心分离加热法（快速检查）
两组发酵液的上清液（A1）以4000rpm离心20min，721分光光度计测定其中一部分。另取5ml上清液置于试管中，水浴煮沸2min（A2）。检测并记录A2溶液的光密度。
2噬菌体效价测定：
① 倒板
将下层蛋白胨固体培养基倒入11个无菌培养皿中，冷却至45℃左右，每盘倒入10ml左右培养基，平放。浓缩后，在培养皿底部标记噬菌体的稀释度。
② 稀释噬菌体
按10倍稀释法，抽取0.5ml大肠杆菌噬菌体，注入含4.5ml 1%蛋白胨水的试管中，即稀释至10-1，再稀释至10-6倍。
3、噬菌体与菌液混合：
11根灭菌空管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。取10-4、10-5、10-6噬菌体稀释液0.1ml，置于上述数量的无菌试管中。为每个稀释液平行制作三个试管。另两根对照管加无菌水0.1ml，每根管分别加入大肠杆菌悬液0.2ml。摇动试管使细菌液和噬菌体体液混合均匀，37℃水浴浸泡5min，噬菌体颗粒完全吸附并侵入噬菌体细胞。
4. 接种上层平板：
将上层融化保存于45℃的11片蛋白胨半固体琼脂培养基（5ml）分别加入含噬菌体和敏感菌液的混合管中。它们被迅速揉捏，并立即倒入相应数量的底中板表面。倒的时候，摇晃盘子使它迅速扩散开来。凝固后37℃孵育。
5观察和计数：
观察并记录平板中的菌斑，公式为：n=Y/v%×X
（n：功效值，Y：平均菌斑数/皿，V：取样量，X：稀释度
