细胞凋亡检测实验简介 
凋亡检测主要用于以下实验过程：1.研究不同类型的病理标本，包括肿瘤细胞和组织； 2.从促进肿瘤细胞凋亡基因治疗的角度进行临床诊断和治疗，新药开发，生物制品开发，肿瘤放疗和化疗以及探索； 3.进行相关疾病的早期发现以及放疗和化疗效果评估等实验。

1.凋亡检测实验的目的：
1.掌上细胞凋亡细胞的形态特征
2.通过实验通过用荧光探针对细胞进行双重标记来检测正常的活细胞，凋亡细胞和坏死细胞的方法。

2.细胞凋亡检测实验的实验原理：
       根据其性质，来源和生物学意义，细胞死亡可分为凋亡和坏死不同的两种类型。细胞凋亡在生活过程中无处不在，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是在某些生理条件下顺序发生的一系列事件的组合。它是一种自主控制，细胞可以根据某些法律程序终止其生命。细胞凋亡具有可识别的形态和生化特征。
      从形态上可以看出，凋亡细胞与周围细胞脱离，然后变成圆形，细胞膜向内收缩，细胞质浓缩，内质网扩张，细胞核收缩破裂，分布是块状或新月形。网状细胞和细胞膜的进一步融合将细胞分为许多完全包裹的凋亡小体，最终被吞噬细胞吞噬并消化。在细胞凋亡过程中，细胞内容物不会在细胞外释放，不会影响其他细胞，因此不会引起炎症反应。
       在生物化学中，在大多数细胞凋亡过程中，内源性核酸内切酶被激活，其活性增加。核DNA在核小体的连接处被酶随机切割，并降解为180-200bp的多个片段或其倍数。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，则可以显示出以180-200bp为碱基的DNA阶梯的特征。
       相反，坏死是当细胞受到严重损害时发生的细胞死亡。在坏死的早期，细胞失去质膜的完整性，各种细胞器肿胀，质膜塌陷释放出内含物，引起炎症反应。尽管在坏死过程中核DNA也被降解，但是由于存在各种长度的DNA，碎片无法形成梯形条纹，而是分散的。
       一些轻度的损伤刺激和一些抗肿瘤药物可以诱导细胞凋亡。通常，这些因素还可以在诱导细胞凋亡的同时诱导细胞坏死，这取决于损伤的严重程度和细胞本身对刺激的敏感性。
       头孢噻嗪（HT）是一种自主研发的抗肿瘤药物，对急性髓样白血病，急性单核细胞白血病等有良好的治疗作用。研究表明，HT可以诱导HL-60细胞凋亡2小时，范围为0.02? 5μg/ ml，并表现出典型的凋亡特征。在该实验中，以1μg/ ml HT体外诱导培养的HL-60细胞凋亡，少数细胞也坏死。使用Hoechst33342和碘化丙啶（PI）双重染色，可以区分细胞凋亡，坏死和正常细胞。
      细胞膜是选择性的生物膜，一般的生物染料如PI不能穿过质膜。当细胞坏死且质膜不完整时，PI进入细胞内部，它可以包埋在DNA或RNA中以染色坏死细胞，而不是凋亡细胞和活细胞。一些活细胞染料由于是亲脂性物质，因此可以跨膜进入活细胞，因此可以对活细胞染色。 Hoechst33342是一种低毒的反应性荧光染料。它是二苯并咪唑的衍生物。它特异性结合DNA（主要结合到A-T的碱基区域），显示凋亡细胞和活细胞。看到凋亡小体的任何细胞都是凋亡小细胞。

3.实验所需试剂和材料：
1.试剂：头孢噻嗪（HT），300μg/ ml，100mmol / L Tris-HCl（pH7.5），5mol / L EDTA缓冲液，碱性裂解液：0.2mol / L NaOH，1％SDS 2.乙酸钠：3mol / L KAc（pH 4.8）;异丙醇70％乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。 TBE缓冲液，1％琼脂糖，溴化乙锭。 PI母液：500μg/ ml； Ho33342母液：2 mmol / L。
2.仪器和设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量取样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片

4.凋亡检测实验材料：
将人早幼粒细胞白血病HL-60细胞在含有10％小牛血清的RPMI1640培养基中于37°C和5％CO2培养。

5.凋亡检测方法步骤
1.头孢噻嗪诱导HL-60细胞凋亡
（1）在实验前约24小时，接种两瓶标有①，②的HL-60细胞，每瓶包含约6ml培养基，并在37°C，5％CO2的培养箱中培养。
（2）实验前约2.5小时，当细胞密度达到70％时，在烧瓶①中加入头孢菌素200μl使终浓度为1μg/ ml，在烧瓶②中加入等量的PBS（pH7.4）作为控制。将它们放在培养箱中，继续培养2.5小时。
2. Ho33342和PI双重染色可识别三种类型的细胞
（1）染色：将瓶中的细胞摇匀，并在1.5ml离心管中加入200μl，加入Ho33342母液2μl，PI20μl，并染色15分钟。
（2）滴下：用双面胶带在玻璃载玻片上形成一个小腔，从离心管中取出10 µl上述染色的细胞悬液，在腔中加入盖玻片，并在荧光灯下用紫外线激发显微镜在高倍率下观察，区分三种细胞，并注意三种细胞的比例。

5.实验注意事项：
1. HL-60细胞的诱导培养时间应准确；
2.在荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光脆弱，观察应尽可能快。

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