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蛋白质检测方法（双向凝胶电泳,实验简介,实验步骤,实验所需试剂清单）
Release Time：2020-07-28一、双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较实验简介：
双向凝胶电泳蛋白质检测方法比较实验中蛋白质组学研究需要加压蛋白质分离以及准确而灵敏的质谱鉴定技术，凝胶电泳中蛋白质的着色也会影响蛋白质分离的分辨率以及随后的质谱鉴定，选择合适的蛋白质染色方法将有助于提高蛋白质组学研究结果的质量。
常用的蛋白质染色有四种类型：有机试剂染色，银染色，荧光染色和同位素染色。其中，有机试剂染色以考马斯亮蓝（CBB）代表，该蛋白常用于蛋白质分析，但对低丰度蛋白质显示不佳；银染不够灵敏，但通常与质谱不兼容；荧光染色主要基于SYPRO试剂，蛋白质检测灵敏度高，模拟兼容，但由于需要配备专用的检测仪器和昂贵的试剂，因此可以作为常规方法使用；而同位素着色具有安全性和操作局限性等问题。因此，蛋白质组学研究需要适当的筛选，经济，高检测灵敏度和质谱兼容的蛋白质染色方法，比较了几种考马斯亮蓝染色法和银染色法，并分析了影响染色的因素。
二、双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较实验步骤
（一）、总细胞蛋白的提取
取4个常规培养的急性早幼粒细胞白血病细胞系（NB4）1×107细胞，每个重悬于350μl蛋白分离缓冲液（8mol / L尿素，2g / L CHAPS，2mmol / L TBP，2ml / L载体两性电解质，痕量溴酚蓝色）置于冰浴中进行超声裂解，静置30分钟，以15500×g离心30分钟，然后取上清液进行蛋白质定量。
（二）、单向定量电泳
取蛋白质分子量标准，先以1：2置换，再以1：3逐渐置换，再以4级置换，取15μl样品溶液，加样量的β-半乳糖苷酶为1μg，分别为0.24μg，0.062μg，0.0156μg，0.004μg。做12g / L SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳，并同时电泳4个凝胶，显色性和染色的敏感性。
（三）、二维电泳
取300μl样品溶液，沿水合盘槽边缘从左至右线性添加。选择17cm IPG胶条两面中的其中一面，向下插入进槽中，在等待45min过后，使用一层矿物油浇在最上层覆盖，同时在20°C的条件下使其膨胀11至16小时左右。将溶胀的橡胶条放置在等电聚焦板上，并在Protean IEF池中进行等电聚焦的步骤，此步骤首先需要把反应环境特别是温度调整到20℃的条件下，同时把电压模式调整为：0.5小时，250 V，快速升压；0.5小时，500 V; 10000 V，60000 Vh（伏×小时）。
在IEF之后取IPG胶条，并设置DTT平衡溶液1（尿素6mol / L，SDS 2g / L，0.05mol / L Tris pH 8.8，乙二醇，200ml / L，2g / L）和碘乙酰胺平衡溶液2（与天平溶液1相同，但其中DTT被2.5g / L碘乙酰胺代替）分别轻轻摇动10分钟。将平衡的IPG胶条放在预填充的12g / L SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，密封，在15℃的低温水循环中以15mA /凝胶运行15分钟，最后通过放置于25mA /凝胶的恒定电流中，进行电泳步骤。
（四）、显色性
将提前准备好的SDS-聚丙烯酰胺凝胶拿出，在经过超纯水持续1分钟清洗后，重复2次上述清洗步骤，清洗后所得四块胶分别按四种不同的染色方法开展显色步骤，注意后续显色步骤必须全部都在摇床上开展，四种染色法的成分配置及操作工艺如下：
①传统考马斯亮蓝染色方法：首先把经过清洗的凝胶取出，放置于采用4.6％乙酸，45.4％甲醇配置的固定液中进行固定步骤，时间为1小时左右，之后采用由染色G250，4.6％乙酸，45.4％甲醇，0.1％CBB配置的染色液进行染色步骤，最后通过采用7.5％的乙酸和5％的甲醇配置的渗透液进行后续的替换加脱色步骤，此步骤一直重复到背景清晰为止。
②胶体考马斯亮蓝，cCBB染色法：首先取出已经经过超纯水漂洗好的凝胶，通过采用由8％硫酸铵，0.02％CBB， G2501.6％磷酸，用20％的乙醇上色的胶体考马斯亮蓝G250染色液进行后续染色步骤，次染色法中的替代液体采用的是超纯水，注意液体更换一定要保证3至4次，直至背景清晰为止。
③Coomassie Brilliant Blue，mCBB染色法；此操作方法与上述的②胶体考马斯亮蓝，cCBB染色法原理步骤差不多，只有染色液制备组成步骤有所差异，此法才用的是由20％乙醇、0.12％CBB G250、10％磷酸，10％硫酸铵制备而成的染色液，注意使用此法进行染色时，上色时间需要保证1小时。
④银染（银染）：凝胶漂洗后先被固定液（50％甲醇+ 5％乙酸）固定1小时，随后分别用50％甲醇和超纯水清洗各10分钟，0.02 mg / L Na2S2O3致敏1分钟，超纯水清洗2次，每次1分钟，再用预冷的0.15％AgNO3着色20分钟，超纯水再次清洗2次，每次1分钟，2％Na2CO3 + 0.04％甲醛显色性20?30秒，当溶液变黄以后除去，换新鲜的溶液后继续显色性直至显色性适度后，以5％乙酸终止显色性。
（五）、成像，分析，质谱鉴定
脱色后，将凝胶扫描并通过由GS-800校准的光密度计成像，并用PDQuest软件进行分析。切出蛋白质斑点，用微量酶消化，并进行质谱鉴定。
（六）、结果
1.四种染色法检测蛋白质的敏感性分析
β-半乳糖苷酶的负载量分别为1、0.24、0.062、0.0156和0.004μg。在传统的考马斯亮蓝色染色的条带上，在62ng的水平上仍清晰可见；胶体考马斯亮蓝染色法敏感性更高，清晰可见62ng带；改良的考马斯亮蓝染色法效果更好，在15.6ng水平可见条带。乐队的表演；银染法灵敏度最高，在15.6ng处可见清晰的条带，在4ng处可见微弱的条带。四种染色方法的比较表明，银染色方法具有最高的灵敏度，可以达到纳克水平，其次是改良的考马斯亮蓝染色方法，可以检测到10纳克的蛋白质。胶体考马斯亮蓝染色法和经典考马斯亮蓝染色法稍差，检测水平仅为几十纳克。
2.四种染色法的二维电泳蛋白质点显示比较
NB4细胞的整个蛋白质通过pH 3-10NL的等电点梯度分离。 SDS-PAGE二维垂直电泳后，将其染色并通过三种染色方法成像。传统考马斯亮蓝染色方法的蛋白质斑点可以修整以代替胶体。揭示了考马斯亮蓝染色方法的蛋白质斑点，而改良的考马斯亮蓝染色方法的蛋白质斑点更显着。两次之后，凝胶背景更清晰。用PDQuest软件分析，用pH 5-8 IPG分离3张图片中的蛋白质斑点，分别用改良的考马斯亮蓝染色法和银染色法分别显示蛋白质斑点，样品量相同。蛋白质斑点的数量是等效的，但银染的蛋白质斑点明显显示出较重的着色。这具有与单向电泳相同的效果。
3.四种染色方法的可操作性比较
在比较其蛋白质检测的灵敏度的同时，还比较了质谱的操作替代，安全性和蛋白质鉴定成功率。比较表明，考马斯亮蓝染色方法是选择性的，但更换耗时。经过改进，可以实现无毒运行，质谱的集成度更高。银染步骤很多，但是时间很短。操作中存在有甲醇，甲醛等有毒物质，质谱的相容性低。即使我们选择的银染色方法也被报道与质谱兼容，但它仍然显示出较低的蛋白质识别率，不如考马斯亮蓝染色。
三、蛋白质检测方法实验所需试剂清单：
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 尿素 | JY0003 | 57-13-6 | |
| 2 | CHAPS | HXH500662 | 75621-03-3 | |
| 3 | DTT（二硫苏糖醇） | HCM000375 | 3483-12-3 | |
| 4 | SDS溶液 | SS0013 | 151-21-3 | |
| 5 | Tris | SS1426 | 77-86-1 | |
| 6 | 乙二醇 | JT25994 | 107-21-1 | |
| 7 | 硫代硫酸钠,五水 | SS0127 | 10102-17-7 | |
| 8 | 甲醛 | JT12051 | 50-00-0 | |
| 9 | 硫酸铵 | JT10921 | 7783-20-2 | |
| 10 | 磷酸 | JT11391 | 7664-38-2 | |
| 11 | 无水碳酸钠 | JT8648 | 497-19-8 | |
| 12 | 溴酚蓝 | SX0029 | 115-39-9 | |
| 13 | 碘乙酰胺 | HCM79334 | 144-48-9 | |
| 14 | 2ml圆底连盖离心 | F-EP020 | ||
| 15 | 1.5ml尖底连盖离心管 | F-EP015 | ||
| 16 | 丙烯酰胺 | JQ0010 | 79-06-1 |
