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制备琼脂糖凝胶的实验介绍
Release Time：2020-07-21一、制备琼脂糖凝胶的实验简介：
※ 制备琼脂糖凝胶所学的琼脂糖是由半乳糖及其衍生物组成的中性物质，不带电荷，琼脂胶是一种含有硫酸盐和羧基的强酸多糖，由于这些基团带电，因此可以在电场作用下产生强烈的电渗现象，加之硫酸根自由基可与某些蛋白它影响电泳速度和分离效果，因此，目前，琼脂糖通常用作板电泳的电泳载体，分离蛋白和同工酶。可以将琼脂糖电泳与免疫化学技术进行结合，发展成为了免疫电泳技术，该技术可以鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，琼脂糖凝胶电泳经常应用于分离和鉴定核酸，如：
DNA鉴定，DNA限制性内切核酸核酸酶Atlas生产等，由于此方法易于操作，设备简单，样品量小且具有高分辨率，因此已成为一种基因工程研究中常用的实验方法之一。
二、制备琼脂糖凝胶所需材料及试剂：
琼脂糖、EDTA（PH8.0）；Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或者采用Tris-磷酸（TPE），TAE缓冲溶液液、溴酚蓝、Tris-EDTA缓冲溶液、蔗糖、溴化乙锭（EB）、甘油。
三、制备琼脂糖凝胶的实验步骤
1.核酸分子大小与琼脂糖浓度之间的关系
①凝胶中DNA分子的大小，DNA片段的迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此将已知大小的标准物移动的距离与未知片段的距离进行比较。未知片段的大小可以测量。但是，当DNA分子的大小超过20kb时，很难用普通的琼脂糖凝胶分离它们，此时，电泳的迁移率不再取决于分子大小。因此，当通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不应超过该值。
②琼脂糖浓度如下表所示，电泳时需要使用不同浓度的琼脂糖凝胶分离不同大小的DNA。
| 琼脂糖的浓度/％ | 线状DNA的大小/kb |
| 0.3 | 60－5 |
| 0.6 | 20－1 |
| 0.7 | 10－0.8 |
| 0.9 | 7－0.5 |
| 1.2 | 6－0.4 |
| 1.5 | 4－0.2 |
| 2.0 | 3－0.1 |
具有不同构型DNA移动的速度顺序依次为：共价闭合的环状DNA（cccDNA）>线性DNA>开放的双链环状DNA。当琼脂糖浓度过高时，环状DNA是（通常为球形）无法进入凝胶，相对迁移率大约为0（Rm = 0），而相同大小的直双链DNA（刚性杆状）可以在长轴方向上移动（Rm> 0），可以看出这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，它也受电流强度和离子强度的影响缓冲区。
3.电泳法
①凝胶型
用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型和水平型（平板型）。在水平电泳中，凝胶板完全浸没在电极缓冲液下1-2mm，因此也称为浸入式。目前，后者较为常用，因为制作凝胶和添加样品更加方便，电泳槽简单，易于制作，并且可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节省了凝胶，因此它更受欢迎。
②缓冲系统
当缺少离子时，电流太小，DNA迁移缓慢；相反，高离子强度的缓冲液由于大电流会产生大量的热量，在严重的情况下，会导致凝胶融化和DNA变性。
常用的运行缓冲区是EDTA（PH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol / L（pH7.5?7.8），电泳缓冲液通常制备为浓缩原液，使用前将其稀释至所需倍数。
TAE的缓冲区容量较低，而后两者的缓冲区容量足够高，因此更常用，TBE浓溶液的长期储存中可能会发生沉淀，为了避免此缺点，在室温下保存5倍溶液。将0.5倍工作溶液稀释10倍以提供足够的缓冲容量。
③凝胶的制备
使用稀释的电极缓冲液作为溶剂，在沸水浴或微波炉中制备一定浓度的溶胶，将其倒入水平塑料框或垂直塑料膜中，插入梳子，然后自然冷却。
④样品制备和样品添加
将DNA样品溶解在适量的Tris-EDTA缓冲液中，缓冲液包含0.25％的溴酚蓝或其他指示剂染料，10％-15％的蔗糖或5％-10％的甘油以增加其比重并浓缩样品，为避免蔗糖或甘油在电泳结果中产生U形带，可以使用2.5％Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。⑤电泳
琼脂糖凝胶分离大分子DNA的实验条件结果表明，低浓度低电压下分离效果更好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成比例。但是，当电场强度增加时，较大的DNA片段的迁移率增加相对较小。因此，随着电压升高，电泳分辨率降低。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V / cm。
电泳系统的温度对琼脂糖凝胶中DNA的电泳行为没有显着影响。电泳通常在室温下进行。仅当凝胶浓度小于0.5％时，为了提高凝胶硬度，才可以在4℃下进行电泳。
⑥染色和拍照
常用的荧光染料溴化乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，使用紫外分析仪拍照或使用凝胶成像系统输出照片并进行相关数据分析
五、制备琼脂糖凝胶实验所需试剂清单：
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 琼脂糖 | SF0012 | 9012-36-6 | |
| 2 | EDTA溶液 | SS6108 | ||
| 3 | TAE缓冲液 | HC1409 | ||
| 4 | Tris-乙酸电泳粉剂 | HC1425 | ||
| 5 | Tris-磷酸电泳缓冲液 | HC1431 | ||
| 6 | TBE缓冲液 | HC1998 | ||
| 7 | Tris-EDTA缓冲液 | HC2036 | ||
| 8 | 溴酚蓝 | SX0029 | 115-39-9 | |
| 9 | 蔗糖 | SS1498 | 57-50-1 | |
| 10 | 甘油 | JT26018 | 56-81-5 | |
| 11 | 溴化乙锭（EB） | SS1957 | 1239-45-8 |
