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提取细菌DNA的实验方法
Release Time：2020-07-21一、提取细菌DNA方法的介绍
提取细菌DNA一般可选用革兰氏阴性细菌，例如：大肠杆菌，通常选取的细菌有三种选择。
二、提取细菌水煮模板法-主要用于PCR反应
（一）水煮模板法的实验步骤
1.在LB或脑心板上接种单个菌落，在37摄氏度下连续画一条线培养18-24小时。
2.将接种了1?2种蘑菇的苔藓放入150微升三蒸馏水中，搅拌均匀，然后在100摄氏度下煮沸10分钟。
3.以12000 rpm离心10分钟，取出上清液，并保存在-20°C下以备后用。
最简单的操作的试剂要求低。缺点是纯度不够高，可能包含RNA和蛋白质等杂质。但是PCR反应模板足以用于一般检测目的。
有人说，这种方法可用于制作用于扩增4kb以下片段的模板，而编辑者可通过这种模板PCR扩增3500bp片段。编者建议：用这种方法获得的模板存储时间短，强烈建议每月复制一次。
三、提取细菌DNA水煮模板法的实验试剂
| 序号 | 产品 | CAS号 | 货号 | 备注 |
| 1 | LB营养琼脂 | PYJH50087 |
四、提取细菌DNA，采用CTAB / NaCl法
1.在5ml LB中接种单个菌落，在30°C下培养过夜，
2.将1ml种子培养液加入100ml 2％LB中，并在37°C和220r / min下培养16小时；
3.以5000r / min的速度离心10分钟，并丢弃上清液。
4.加入10ml TE进行离心和洗涤后，用10ml TE溶解细菌，充分混合，然后在-20℃储存以备后用。
5.取3.5ml细菌悬浮液，并添加184μl10％SDS混合均匀，加37μl10mg/ ml蛋白酶K，混合均匀，在37℃孵育1小时
6.加入740μl5mol / L NaCl，然后加入512μlCTAB / NaCl，充分混合，并在65°C孵育10分钟。
7.加入等体积的氯仿/异戊醇，混合均匀，以10000r / min的速度离心5分钟，然后保存上清液。
8.在上清液中加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混合均匀，以10000r / min离心5分钟，然后保存上清液。
9.加入0.6倍的异丙醇，混合均匀，以10000r / min离心5分钟，收集DNA沉淀物，并用70％乙醇离心洗涤DNA沉淀物。
10.用1ml TE溶解DNA，加入RNaseA至终浓度20μg/ ml，并在4℃下保存。
通过CTAB / NaCl方法提取的DNA具有更高的纯度，更少的蛋白质杂质和更长的存储时间。编辑者更喜欢在孵育步骤5中添加最终浓度为20μg/ ml的RnaseA，以便最后没有RnaseA污染。每个步骤都更加详细，并且获得的DNA可用于Southern印迹法。
建议：DNA可以在-20°C下长期保存，但应尽量减少反复冻融，否则会影响DNA质量。
（二）CTAB / NaCl法的实验试剂
| 序号 | 产品 | CAS号 | 货号 | 备注 |
| 1 | Tris-EDTA缓冲液 | HC2021 | ||
| 2 | SDS | 151-21-3 | SS0013 | |
| 3 | 蛋白酶K | 39450-01-6 | SS2244 | |
| 4 | 氯化钠 | 7647-14-5 | JT0001 | |
| 5 | 十六烷基三甲基溴化铵CTAB | 57-09-0 | SS0030 | |
| 6 | 异戊醇 | 123-51-3 | JT26013 | |
| 7 | 氯仿 | 865-49-6 | JW0132 | |
| 8 | 异丙醇 | 67-63-0 | JT25997 | |
| 9 | 核糖核酸酶RNaseA | 9001-99-4 | SS1470 |
四、提取细菌盐析法
（一）盐析法的实验步骤
1. 1.5ml对数相细菌液12000rpm 30 s2. 12000rpm 30 s
2. 200ul裂解缓冲液（与CTAB / NaCl方法相同），37℃，1小时
3. 66ul 5M NaCL，拌匀，12000rpm 10min
4.将上清液移至带有粗吸管头的新试管中
5.将等体积的苯酚以12000rpm的速度充分混合3分钟，重复萃取直至没有蛋白质层
6.取水层，与等体积的氯仿混合，以12000rpm的转速混合3分钟
7.将上清液转移到新管中，其体积是预冷却的无水乙醇的两倍
8. -20°C，20分钟，14000rpm，15分钟
9.400ul 70％冷乙醇洗涤
10.干燥，100ul 20ug / ml RNaseA，37C，30分钟
11.绝对乙醇沉淀量的2倍，用70％冷乙醇洗涤
12.干燥并溶于100ul TE中
在方法1和方法2之间，尽管CTAB可以更好地去除糖分，但CTAB本身也具有毒性，因此该方法放弃了CTAB。
革兰氏阳性细菌，因为细胞壁的结构与阴性细菌不同，所以裂解比阴性细菌更麻烦。可以使用CTAB / NaCl方法进行一些修改。在第四步中，在37°C下添加终浓度为2mg / ml的溶菌酶。孵育1小时。
（二）盐析法的实验试剂
| 序号 | 产品 | CAS号 | 货号 | 备注 |
| 1 | 无水乙醇 | 64-17-5 | JT26000 |
五、提取细菌DNA的实验结果
实验记录：提及基因最好切掉枪头的尖端（在酒精灯上迅速切割以使骨折平滑后）。以免破坏基因组！排水时最好风干！
