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怎么做交联染色质免疫共沉淀（X-ChIP）实验
Release Time：2020-07-20一、交联染色质免疫共沉淀（X-ChIP）实验简介：
二、交联染色质免疫共沉淀（X-ChIP）实验所需材料及试剂：
三、交联染色质免疫共沉淀（X-ChIP）实验步骤
1.交联和细胞收获
甲醛可以使蛋白质与DNA交联。交联结果的质量取决于对交联时间的把握，样品的交联时间通常为2-30分钟，过度的交联会降低抗原结合和超声破碎效率。抗原决定簇也将被掩盖，添加甘氨酸可以消除甲醛并终止交联反应。
1.1准备两个充满细胞的150cm2细胞培养皿（1 * 107-5 * 107个细胞/皿），将甲醛直接滴入用PBS洗涤的细胞培养皿中，使最终浓度达到0.75％，然后在室温下缓慢旋转10分钟以使蛋白质和DNA交联。
1.2加入甘氨酸使终浓度达到125mM，并在室温下振荡孵育5分钟。
1.3用10ml预冷的PBS洗涤细胞两次。
1.4用刮板将收集的细胞放入5ml的预冷PBS中，并转移到50ml的试管中。
1.5向培养皿中加入3ml PBS，将剩余细胞转移至50ml管中，并以1000g离心5分钟。
1.6倒出上清液，并用FA裂解缓冲液（1x107cells /750μl）重悬沉淀。
初始细胞应为1 * 107-5 * 107，并按上述终浓度0.75％甲醛和甘氨酸处理。用预冷的PBS洗涤3次，以1,000g离心5分钟，然后用FA裂解缓冲液重悬沉淀。
2超声波破坏
2.1超声裂解细胞悬液可将DNA均匀地破碎成500-1000bp的片段，不同的细胞系需要不同的超声时间才能获得最佳结果，应通过时间梯度超声选择交联细胞，以选择最佳超声条件，样品经过时间梯度，分离DNA，检测片段大小序列，并在1.5％琼脂糖凝胶上进行分析。
2.2超声波破坏后，8000g，30秒，4°C,离心。将上清移入新的管子中，开始准备进行染色质免疫共沉淀（IP）。
2.3每个超声样品取50ul，此时样品标记为INPUT，用于定量DNA浓度和PCR空白对照。超声后的染色质应立即在液氮中冷冻或在-70°C下保存2个月，避免反复冻融。
3.检测DNA浓度
3.1INPUT样品用于计算后续IP样品的DNA浓度，DNA可以通过PCR纯化试剂框（添加70ul洗脱液，然后输入3.2a）或使用苯酚/氯仿萃取（添加350ul洗脱液，然后按照3.2b）2a。加入2ul RNaseA（0.5mg / ml），加热至65°C，摇动4-5小时或过夜以反向交联，使用PCR纯化试剂盒中的制造商说明纯化DNA，将样品冷冻并储存在-20℃，之所以将RNaseA添加到样品中，是因为使用PCR纯化试剂盒时高浓度的RNA会干扰DNA的纯化，确定纯化柱的饱和度。
3.2加入5ul蛋白酶K（20mg / ml），加热至65°C并摇动4-5小时或过夜以反向交联，用苯酚/氯仿提取的DNA用乙醇沉淀在10ul糖原（5mg / ml）中，重悬于100ul水中，将样品冷冻并储存在-20℃，用蛋白酶K处理样品，以将相邻的肽切割成具有羧基的芳族和脂族氨基酸，蛋白质和DNA之间的交联被DNA纯化打断。
3.3检测DNA浓度，将5ul纯化的DNA放入995ulTE中，将原始溶液稀释200倍，并测量其OD260，则DNA的浓度为OD260x10,000.μg/ ml，可以计算出染色质产物的DNA浓度。
4.免疫共沉淀
4.1对于从2.2获得的染色质产品，建议每个IP样品使用25ug DNA，为每个样品添加RIPA溶液的比例为1:10，需要样品作为空珠的对照。
4.2将一抗添加到每个样品（空珠对照样品除外）中，根据过去的经验添加抗体的量，1-10ug抗体/ 25ugDNA效果更好。
4.3向所有样品中添加20ul蛋白A / G珠子（之前已超声处理成单链鲱鱼精子DNA和BSA吸附，请参见步骤4.3a），在4°C摇动IP过夜，3a蛋白A / G珠和单链鲱鱼精子DNA，如果同时使用蛋白A珠和蛋白G珠，则将两个珠等量混合，并用RIPA溶液洗涤3次，除去RIPA溶液，添加单链鲱鱼精子DNA至珠的最终浓度至75ng /μl，然后使用BSA将珠的最终浓度设定为0.1μg/μl，加入两倍体积的珠子，并在室温下孵育30分钟，用RIPA洗涤一次，然后添加相同体积的RIPA。
4.4将蛋白A / G珠以2000g离心1分钟，然后除去上清液。
4.5用1ml WashBuffer溶液，2,000g，离心1分钟洗涤小珠3次，然后除去上清液，6用1ml FinalWashBuffer溶液，2,000g，离心1分钟洗涤小珠一次，并除去上清液，如果观察到背景很高可增加洗涤次数，另外，超声处理后的染色质也可以在步骤4.2之前与蛋白A / G珠一起孵育1小时，可以通过此附加步骤除去任何非特异性吸附，将上清液（超声染色质）倒入新管中，使用抗体和珠子。
5.洗脱和反向交联
5.1使用120ul ElutionBuffer将蛋白A / G珠添加到蛋白A / G珠中，并在30°C摇动15分钟以洗脱DNA。
5.2以2000g离心1分钟，然后将上清液转移至新试管中，此时样品可在-20°C下冷冻3DNA可通过PCR纯化试剂盒纯化或苯酚/氯仿沉淀，4DNA量水平可通过定量PCR检测，引物和探针通常可以使用定量PCR机上的软件进行设计，也可以使用在线设计软件。
四、交联染色质免疫共沉淀（X-ChIP）实验所需的试剂清单：
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 乙醇 | CCF12679 |
127852-29-3 | |
| 2 | 甲醛 | CCF10222 | 349149-07-1 | |
| 3 | 甘氨酸 | SS3763 | 56-40-6 | |
| 4 | 90mm*20mm 塑料培养皿(灭菌） | FM-90-G | ||
| 5 | 10*10cm方形塑料培养皿(灭菌） | FM-100-F | ||
| 6 | PBS | HC1488 | ||
| 7 | 琼脂糖 | SF0013 | 9012-36-6 | |
| 8 | 苯酚 | JT24025 | 108-95-2 | |
| 9 | 氯仿 | BDM000285 | 67-66-3 | |
| 10 | RNaseA | HC1334 | ||
| 11 | 蛋白酶K | SS2244 | 39450-01-6 | |
| 12 | RIPA裂解液 | HC1242 |
