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测定叶绿素含量
Release Time：2020-07-20一、测定叶绿素含量实验原则
※ 测定叶绿素含量是根据兰伯特-比尔定律，有色溶液的吸光度A由叶绿体色素提取物在可见光谱上的吸收来确定。可以使用分光光度计在某些特定波长下计算提取物中每种色素的吸光度，它与溶质浓度C和液体层L的厚度成正比，即A =αCL，其中：α比例常数。
※ 当溶液浓度为百分数且液体层厚度大约为1cm的时候，α 被定义为物质的吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸收系数，可以通过测量在不同波长下具有已知浓度的纯物质来进行测量。如果溶液中存在几种吸收剂，则在一定长度下混合溶液的总吸光度等于相应波长下的吸光度之和中各组分的总吸光度。这就是吸光度的可加性。
※ 要测定叶绿体颜料混合提取物中的叶绿素a，b以及类胡萝卜素的含量时，只需要确定提取物在特定波长下吸光度系数A，并根据该波长下的叶绿素a，b以及类胡萝卜素，就可以消除在确定叶绿素a和b时，由于类胡萝卜素带来的干扰，所用单色光的波长选择了红光区域中叶绿素的最大吸收峰。
二、测定叶绿素含量所需的实验材料，设备和试剂
| 测定叶绿素含量所需的试剂清单 | ||||
| 序号 | 产品 | CAS号 | 货号 | 备注 |
| 1 | 乙醇95% | 64-17-5 | JT26000 | |
| 2 | 甲醛 | 50-00-0 | JT12051 | |
| 3 | 石英砂 | 14808-60-7 | JT0062 | |
| 4 | 碳酸钙粉 | 471-34-1 | JT8655 | |
（2）所需的仪器设备：1.分光光度计； 2.砂浆； 3.电子天平（感官0.01g）； 4.深色的容量瓶； 5.小漏斗； 6.吸收纸； 7.定量滤纸； 8.滴管； 9.擦拭边框纸。
（3）所需的试剂：96％乙醇（或80％甲醛），石英砂；碳酸钙粉末。
三、测定叶绿素含量的实验步骤
1.测试叶绿素前首先需要取新鲜的植物叶子（或其他绿色组织）或干物质，擦去组织表面的污垢，切成小块（除去中脉），并充分混合。
2.然后称取新鲜切碎的样品0.2g，共3份，放在研钵中，加入少量石英砂，碳酸钙粉和2-3ml 95％乙醇，研磨成均匀的浆液，再加入10ml乙醇，并继续研磨，直到组织变白。静置3-5分钟。
3.取一张滤纸，放入漏斗中，用乙醇润湿，将提取物沿玻璃棒倒入漏斗中，过滤至25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵，杵和残留物几次，最后一次将残留物一起倒入漏斗中。
4.使用滴管吸取乙醇，并将滤纸上的所有叶绿体颜料洗入容量瓶中。直到滤纸中没有绿色和残留物为止。最后，用乙醇稀释至25ml并摇匀。
5.将叶绿体色素提取物倒入比色皿中，光路为1厘米。以95％乙醇为空白，在665nm和649nm处测量吸光度。
四、、测定叶绿素含量实验结果的计算：
将测得的吸光度的值代入方程中：Ca = 13.95A665-6.88A649; Cb ＝ 24.96A649-7.32A665。依照实验数据计算，可得出叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca，Cb：mg / L），两者之和为叶绿素的总浓度。最后，可以根据以下方程式计算得出植物组织中叶绿素的含量：
※ 叶绿素的含量测定结果（mg / g）= [叶绿素的浓度×叶绿素的提取量×混合倍数] /样品鲜重（也可以采用样品干重计算）。
