购物车 
腺病毒包装，纯化和感染
Release Time：2020-07-17一、腺病毒包装，纯化和感染技术介绍：
Adeasy系统利用了高感染能力和高浓度腺病毒的优势，并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使其成为多种安全有效的病毒载体。使用E1基因293细胞作为包装细胞，病毒颗粒通过倍增比例富集，并通过CsCl梯度离心和透析分离和纯化。对于插入的细胞系，可以达到近100％的感染效率。但是，应该指出的是，Adeasy还具有所有功能性病毒载体或转染试剂均会降解的细胞毒性问题。
二、实验所需试剂：
| 序号 | 产品 | CAS号 | 货号 | 备注 |
| 1 | TBS缓冲液 | HC0766 | ||
| 2 | Tris | 77-86-1 | SS1426 | |
| 3 | NaCl | 7647-14-5 | JT0001 | |
| 4 | CsCl 氯化铯 | 7647-17-8 | JT1620 | |
| 5 | 50ml螺口圆底离心管 | F-EP500-U | ||
| 6 | 聚乙烯 | 9002-88-4 | LSH78343 | |
| 7 | 透析袋 | |||
| 8 | 甘油 | 56-81-5 | SS1820 |
2.再生腺病毒质粒；
3. Pac I核酸内切酶；
4.与质粒回收有关的试剂；
5.细胞培养，转染相关试剂；
6. TBS：10mM Tris，0.9％NaCl，pH 8.1；
7. 40％CsCl：将28.45 g CsCl溶解在42.7 ml TBS中，并在4度下保存；
8. 15％CsCl：9.085 g CsCl溶解在47.69 ml TBS中，在4度下保存；
9. Beckman离心管：14 * 89 mm，SW41转子；
10.聚乙烯（sigma），10 mg / ml；
11.透析袋：Spectrum Co.（成卷供应，含有少量甘油，硫化物和重金属），MW = 8000?14400；
12.灭菌的甘油。
三、实验操作过程：
1.转染前24小时将293细胞（E1转化的人类胚胎肾细胞移植到1个或2个60 mm培养板中，使细胞汇合并在转染过程中合并50-70％；
2.转染前，用Pac I处理靶质粒（通常一个60 mm细胞盘需要6μgDNA）。处理后，将质粒用乙醇沉淀，并重悬于20μl无菌水中；
3.用PEI或其他转染试剂用6μgPac I处理的质粒转染细胞；
4. 8小时后，取出混合溶液，并加入4 ml DMEM完全培养液（10％CBS，1％Pen / Strep）；
5.转染后7至10天，用细胞刮刀（不是减肥酶）从烧瓶中刮出细胞，然后转移到50ml锥形管中。离心后，将细胞重悬于2.0 ml PBS或整个培养液中。将细胞在液氮中冷冻，溶于37℃水浴中，并还原至反相。此步骤执行4次。储存时注意不要反复冻融，可在-20℃下储存；
6.以50-70％的融合率将293细胞铺在60mm培养皿中，并以30-50％的体积比加入含病毒的上清液。感染后2-3天可以看到明显的细胞分裂或CPE。
7.当1/3至1/2的细胞漂浮或漂浮时，通常在感染后3-5天收集病毒。重组腺病毒的存在可以通过Western blot或PCR进一步确认（5μl病毒上清液加10μlPCR级蛋白酶K，在55℃消化1小时，然后将样品煮沸5分钟，离心以1-2μl进行PCR）反应）;
8.根据步骤5中的方法收集病毒上清液。在这种情况下，通常可以收集至少107个感染颗粒/毫升病毒。每轮扩展都应将梯度增加一个数量级。
9.为了进一步扩增，将步骤8中获得的病毒上清液进一步用100mm培养板中的细胞感染，并按照步骤5的方法收集病毒，并伴随在150mm细胞培养物中感染293细胞。用足够的病毒板;
10.向Beckman离心管中加入15％CsCl和40％CsCl制备CsCl梯度溶液。
11.将最终富含病毒颗粒的病毒上清液加入CsCl梯度溶液中；
12.超速离心，30000 rpm，4度离心16小时；
13.离心后，应有两个谱带。位置较高而颜色较弱的条带主要是腺病毒空壳，不能感染。另外，更亮的波段包含我们需要收集的活病毒颗粒。用16号针头收集该试纸条。
14.在TBS中透析1小时，然后在含有10％甘油的TBS中透析两次，每次1小时。
15.将纯化的腺病毒分成EP管；
16.用Eppendorf生物光度计测量透析液中的总蛋白，1μg病毒蛋白相当于4×109病毒颗粒；
17.长期储存于-70度，短期可恢复至4度，避免反复冻融；
18.由于腺病毒对不同细胞系的感染效率不同，并且考虑到病毒颗粒的细胞病毒株，所需的病毒量通常通过梯度感染的方法来确定。用相对细胞数为1：1、10：1、100：1和1000：1的病毒颗粒感染靶细胞。加入相对体积为1：1000的聚乙烯。将平板在37
