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siRNA的转染实验
Release Time：2020-07-15一、将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法：
※ 磷酸钙共沉淀
将氯化钙，RNA(或DNA )和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA 且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA 复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
将氯化钙，RNA(或DNA )和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA 且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA 复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
※ 电穿孔法
电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
※ DEAE-葡聚糖和polybrene
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA 分子使得DNA 可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA 复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
※ 机械法
转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA ，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
5.阳离子脂质体试剂电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
※ DEAE-葡聚糖和polybrene
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA 分子使得DNA 可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA 复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
※ 机械法
转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA ，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA 的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA 并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA 自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA -阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA 就会被导入培养的细胞。现存对DNA 转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。
二、实验所需试剂
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS号 | 备注 |
| 1 | 1000ul蓝吸头 | FT-1000 | ||
| 2 | 200ul黄吸头 | FT-200 | ||
| 3 | 甘油 | JT26018 | 56-81-5 | |
| 4 | 磷酸缓冲液 | HC1578 | ||
| 5 | DEAE-葡聚糖 | HC0862 |
