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蛋白提取实验
Release Time：2020-07-13一、蛋白提取实验简介：
当前，最常用的方法是使用溶液法进行蛋白质提取（例如RIPA裂解物），但是在蛋白质提取中通常会产生两种不同的成分，即RIPA可溶性和RIPA不溶性成分。通常，RIPA不溶成分会被我们直接丢弃并忽略。但是有文章证实，丢弃的RIPA不溶成分中存在许多蛋白质。换句话说，通过溶液法提取的总蛋白质不是完整的蛋白质，而只是一些可溶性蛋白质。
蛋白质的溶液提取将人工激活caspase-3和caspase-7；它还会人为地激活某些激酶活性；影响磷酸化研究；影响细胞外基质；影响定量，定性蛋白质研究。目前，通过离心柱法提取蛋白质可以解决上述问题。只需通过柱子添加裂解物和离心机，而不会产生不溶成分，就可以提取出完整的总蛋白！
二、蛋白提取实验所需材料及试剂：
从 15-20 mg 组织中提取，对于昆虫组织，例如果蝇，使用 15-20 个幼虫，蛹或成虫样本。如果起始量较大或者较小，需调整相应裂解液的用量比例。
三、蛋白提取实验步骤：
1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷
2. 将 15-20 mg 组织放置于离心管柱上，用塑料棍扭转研磨 50-60 次，加入 200ul 细胞裂解液，继续研磨 30-60 次。（组织用量不要过量，无需过度研磨，裂解液可分两次加入以得到最佳效果）注意：塑料研磨棒可以重复使用，用蒸馏水彻底冲洗干净，用纸巾擦干。
3. 盖上盖子室温孵育 1-2 分钟，14000-16000rpm 离心 1-2 分钟取出。
4. 立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。
请注意：部分未完全裂解的组织不会影响样品质量。
天然总蛋白提取（SN-002）
1. 将天然细胞裂解液（SN-002），离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。
2. 将 15-20 mg 组织放置于离心管柱上，用塑料棍扭转研磨 50-60 次，加入 200ul 天然细胞裂解液（SN-002），继续研磨 30-60 次。（组织用量不要过量，无需过度研磨，裂解液可分两次加入以得到最佳效果）。注意：塑料研磨棒可以重复使用，用蒸馏水彻底冲洗干净，用纸巾擦干。
3. 开盖冰上孵育 5 分钟，盖上盖子，4℃，14000-16000rpm 离心 1-2 分钟取出。
4. 立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。
细胞样品总蛋白提取
变性总蛋白提取（SD-001）
A．非贴壁细胞
1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。
2. 低速离心收集细胞，在 1.5 ml 离心管中加入预冷的 PBS，旋窝震荡,3000rpm 离心 2-3 分钟清洗细胞。吸去上清，剩余与细胞体积相同体积的 PBS。涡旋震荡重悬细胞。
3. 加入表格 1 中相应体积的细胞裂解液，涡旋震荡裂解细胞。（细胞数量和裂解液须保证对应关系，以达到最佳提取效率）请注意：部分未完全裂解的细胞不会影响样品质量。
4. 将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中，14000-16000rpm 离心 30 秒取出
5. 立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。
表格 1，不同细胞体积应加入相应体积裂解液
| 细胞体积（ul） | 裂解液（ul） | 相当细胞量# X 106 |
| 3 | 20 | 0.3 |
| 5 | 50 | 0.5 |
| 10 | 100 | 1 |
| 20 | 200 | 2 |
| 40 | 500 | 3 |
B． 贴壁细胞
1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷
2. 将预冷的 PBS 直接加入培养板，培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞，吸去上清。
3. 按照表 2 中将相应体积的细胞裂解液均匀的加入整个器皿表面，用移液器吹打几次，将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中，14000-16000rpm 离心 30 秒取出。（如提取浓度不佳，可减少裂解液使用量）
4. 立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。
表格 2，不同贴壁细胞量应加入相应体积裂解液
| 器皿 | 细胞数量 | 裂解液（ul） |
| 24孔板 | 0.1-0.2 Million | 50 |
| 6孔板 | 0.6-0.8 Million | 200 |
| 25 cm2培养瓶 | 1.5-2 Million | 500 |
A．非贴壁细胞
1. 将天然细胞裂解液（SN-002），离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。
2. 低速离心收集细胞，在 1.5 ml 离心管中加入预冷的 PBS, 旋窝震荡,3000rpm 离心 2-3 分钟清洗细胞。吸去上清，剩余与细胞体积相同体积的 PBS。旋窝震荡重悬细胞。
3. 加入表格 3 中相应体积的细胞裂解液，涡旋震荡裂解细胞 15 秒。将离心管放置于冰上 3-5 分钟然后涡旋震荡 10 秒。（细胞数量和裂解液须保证对应关系，以达到最佳提取效率）
4. 将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中，14000-16000rpm 离心 30 秒取出
5. 立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。
表格 3，不同细胞体积应加入相应体积裂解液
| 细胞体积（ul） | 裂解液（ul） | 相当细胞量# X 106 |
| 3 | 20 | 0.3 |
| 5 | 50 | 0.5 |
| 10 | 100 | 1 |
| 20 | 200 | 2 |
| 40 | 500 | 3 |
1. 将天然细胞裂解液（SN-002），离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。
2. 将预冷的 PBS 直接加入培养板，培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞两次，吸去上清。
3. 按照表 4 中将相应体积的细胞裂解液均匀的加入整个器皿表面，放置于冰上孵育 5 分钟，用移液器吹打几次，将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中，14000-16000rpm 离心 30 秒取出。（如提取浓度不佳，可减少裂解液使用量）
4. 立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。
表格 4，不同贴壁细胞量应加入相应体积裂解液
| 器皿 | 细胞数量 | 裂解液（ul） |
| 24孔板 | 0.1-0.2 Million | 50 |
| 6孔板 | 0.6-0.8 Million | 250 |
| 25 cm2培养瓶 | 1.5-2 Million | 500 |
三、实验所需试剂清单：
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | PBS-EDTA缓冲液 | HC0847 | ||
| 2 | Triton-SDS细胞裂解液 | HC1240 |
