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脯氨酸含量的测定
Release Time：2020-07-13一、实验介绍：
在不利条件下（干旱，盐水，热，冷，冷冻），植物中脯氨酸（脯氨酸，脯氨酸）的含量显着增加。植物中脯氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种倾向于积累更多的脯氨酸。因此，脯氨酸含量的测定可用作抗旱育种的生理指标。此外，由于脯氨酸具有极强的亲水性，因此可以稳定原生质体和组织中的代谢过程，因此可以降低冰点并防止细胞脱水。在低温条件下，植物组织中脯氨酸的增加可以提高植物的抗寒性，因此也可以作为抗寒育种的生理指标。
二、实验的基本原理
当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸在磺基水杨酸溶液中会游离，然后用酸性茚三酮进行热处理，溶液会变红，然后用甲苯处理，所有颜料都会转移到甲苯中，色素的深度表明脯氨酸含量的水平。在520nm波长的比色法中，脯氨酸的含量从标准曲线中找到（或通过回归方程计算）。
三、实验材料，仪器和试剂
| 序号 | 产品 | CAS号 | 货号 | 备注 |
| 1 | 脯氨酸 | 147-85-3 | SY0079 | |
| 2 | 5-磺基水杨酸 | 5965-83-3 | JQ0004 | |
| 3 | 酸性茚三酮 | 485-47-2 | FQ0049 | |
| 4 | 甲苯 | 95-52-3 | JQ0884 | |
| 5 | 冰醋酸 | 64-19-7 | JT11990 | |
| 6 | 磷酸 | 7664-38-2 | JT11391 |
（1）材料：待测植物的叶片（大米，小麦，玉米，高粱，大豆等）。
（二）仪器：1. 722分光光度计； 2.砂浆； 3. 100ml小烧杯； 4.容量瓶； 5.大试管； 6.普通试管； 7.移液器； 8.注射器； 9.水浴； 10.漏斗； 11.漏斗架； 12.滤纸； 13剪刀。
（C）试剂1.茚三酮酸性溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol / L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，保存于冰箱中； 2. 3％磺基水杨酸：用蒸馏水溶解3g磺基水杨酸，稀释至100ml； 3.冰醋酸； 4.甲苯。
四、实验流程
1.标准曲线图
（1）在分析天平上准确称量25mg脯氨酸，将其倒入一个小烧杯中，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加入蒸馏水使体积达到刻度，然后每毫升标准溶液中含有100μg脯氨酸。
（2）脯氨酸系列浓度的制备取6个50ml容量瓶，分别盛有0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0ml脯氨酸原液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，每瓶脯氨酸浓度分别为1， 2、3、4、5和6μg/ ml。
（3）取6个试管，分别吸取2ml标准浓度的脯氨酸溶液，2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，然后在沸水浴中加热每支试管30min。
（4）冷却后，向每个试管中准确加入4ml甲苯，摇动30S，静置一会儿，以便将所有颜料转移到甲苯溶液中。
（5）用注射器将脯氨酸甲苯溶液从每个试管中轻轻吸入比色杯中。使用甲苯溶液作为空白对照，在520 nm波长下进行比色。
（6）标准曲线的绘制：首先根据脯氨酸（X）的浓度求出吸光度值（Y）的回归方程，再根据回归方程绘制标准曲线，计算出脯氨酸的含量（μg）。 2ml测量溶液/ 2ml）。
2.样品测定
（1）脯氨酸的提取：在不同处理下准确称取每片待测植物叶片0.5g的重量，将其放入大试管中，然后向每支试管中加入5ml 3％的磺基水杨酸溶液，并在沸水中提取浸浴10min（在提取过程中经常摇动），冷却后，在干净的试管中过滤，滤液为脯氨酸的提取物。
（2）将2ml提取物移入另一个带塞子的干净试管中，加入2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮试剂，并在沸水浴中加热30分钟，溶液呈红色。
（3）冷却后，加入4ml甲苯，振摇30S，静置一会儿，将上层液体放入10ml离心管中，并以3000rpm离心5分钟。
（4）用移液管在试管中轻轻吸收脯氨酸红色甲苯溶液的上层。将甲苯用作空白对照，并在分光光度计上在520nm的波长处测量比色法以获得吸光度值。
五、实验结果
计算根据回归方程计算（或从标准曲线中得出）2ml测量溶液（Xμg/ 2ml）中脯氨酸的含量，然后计算样品中脯氨酸的百分比。计算如下：脯氨酸含量（μg/ g）= [X×5/2] /样品重量（g）。
