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基因克隆实验（实验操作流程,实验方法）
Release Time：2020-07-09一、基因克隆实验操作流程：
基因克隆实验操作流程如下：首先收集基因信息——引物设计——PCR——回收目的片段——载体连接，并取得连接产物 —— 采用感受态细胞做转化 ——接菌——阳性克隆鉴定(酶切法或采用PCR)——质粒抽提——质粒测序——测序的结果分析——>克隆信息输入数据库中——质粒实物保存。
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS号 | 备注 |
| 1 | CaCl2 | JT0418 | 10043-52-4 | |
| 2 | MgCl2 | JT2113 | 7786-30-3 | |
| 3 | Agarose | SF0014 | 9012-36-6 | |
| 4 | EB buffer | HC1644 | ||
| 5 | LB培养基 | HC1007 | ||
| 6 | 1000ul蓝吸头 | FT-1000 | ||
| 7 | 200ul黄吸头 | FT-200 | ||
| 8 | 2ml圆底连盖离心 | F-EP020 | ||
| 9 | 1.5ml尖底连盖离心管 | F-EP015 |
二、基因克隆实验方法：
2.1 j基因克隆实验设计引物
引物设计要求：引物长度为25bp-35bp.forward primer 和reverse primer 的Tm，为70℃(±4℃)，且两条引物的Tm 相差不超过4℃。引物之间及引物本身避免形，成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板不能有任何错配。
forward primer 5’加: GGCCAATCCGGCC
reverse primer 5’加: GGCCTCTAAGGCC
2.2 PCR
2.2.1 PCR 反应体系
模扳(100ng/ul 质粒) 2.00μl
4dNTP(10mM) 1.00μl
10×PCR Buffer 5.00μl
MgCl2(25mM) 5.00μl
5’Primer (10-12uM) 4.00μl
3’Primer (10-12uM) 4.00μl
5M 甜菜碱 10.00μl
Pfu (5U/ul) 0.50μl
ddH20 18.50μl
总计 50.00μl
2.2.2 PCR 反应过程
1)从cDNA 文库克隆基因
Stage1 Stage 2 Stage3
1 Cycle 30Cycle 1 Cycle
95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃
2min 30sec 30 sec
Xmin(2min/Kb) 10min 1min
备注：Pfu 酶最适延伸温度为68℃。
2)从含目的基因质粒中克隆
Stage1 Stage2 Stage3
1 Cycle 22Cycle 1 Cycle
95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃
2min 30sec 30 sec
Xmin(2min/Kb) 10min 1min
2.3 基因克隆实验中割胶回收目的片段
(QIAquickGel Extraction Kit)
1) 1%Agarose 胶电泳将目的DNA 片段用干净的手术刀割下，放入1.5ml 离心管；
2) 称重后，在1.5ml 离心管中加入3 倍胶体积的buffer QG(100mg 加300ul)；
3) 50℃水浴中放置10min(至胶完全溶解)，每2-3 分钟混匀一次(溶胶液应于buffer QG 颜色相同；
4) 加入1 倍胶体积的异丙醇然后充分混匀，静置片刻；
5) 将样品转移入柱子中(柱子的最大容量为800uL)，然后13000rpm*1min 离心）；
6) 取下柱子，弃流出液，将柱子放回到刚才那个收集管中；
7) 加入0.75mL buffer PE 至柱子，室温放置2-5min，然后13000rpm*1min 离心；
8) 取下柱子，弃流出液，再次13000rpm*1min 离心；
9) 将柱子放置在一支新的1.5mL 离心管中，加入50uL EB buffer (或无菌H2O)至膜中央，静置片刻，然后13000rpm*1min 离心，然后测定浓度。
2.4 基因克隆中连接
在连接反应中通常要求： (目的基因分子数：载体分子数=3：1)连接反应体系
sample + -10*T4 buffer 1.00μl 1.00μl 1.00μl
PGEM-T (50ng/ul) 1.00μl 1.00μl 1.00μl
目的基因(150ng/ul) 1.00μl 1.00μl /
T4 连接酶 0.50μl 0.50μl 0.50μl
补水 6.50μl 6.50μl 7.50μl
于16℃连接过夜或室温(25℃)1 小时以上。
2.5 感受态细胞制备及转化
2.5.1 CaCl2 制备感受态细胞(DH5α 、DH10B、TOP10
1） 接过夜菌 在15ml 试管中加入3ml LB 培养基，从平板上挑取一单克隆接
种，37℃，260rpm，培养过夜，约16 小时。
2） 接菌 取2ml 过夜菌接入200ml 新鲜的LB 培养基， 37℃，260rpm，培
养，直至OD600=0.4-0.5(一般约2 小时),然后将菌液冰浴30-60 分钟。
3） 收菌 4℃，5000rpm×5min，弃上清。
4） CaCl2 悬浮 若50ml 菌液收菌，用10ml 0.1M 的CaCl2 轻轻吹打，充分悬
浮，冰浴10min。
5）离心 4℃，5000rpm×5min，弃上清。
6）CaCl2 悬浮 以2ml 0.1M 的CaCl2 轻轻吹打，充分悬浮，冰浴30min 即感受态制备完成。
此时感受态可直接使用或冰浴过夜第二天使用或加入10%的灭菌甘油，混匀后-80℃冻存，以后使用(一般可存1 个月)。
注： 制备感受态细胞要求严格控制温度，制备过程在冰上操作。
2.5.2 转化(PGEM-T vector)
1) 准备1.5ml 的离心管，冰浴预冷。
2) 取100ul 感受态细胞，加入5ul 连接液，冰浴45-60min。
3) 42℃热刺激90sec。(此关键步骤，一定注意温度及时间)
4) 冰浴2min。
5) 加LB 培养基900ul，37℃，150rpm 培养45-60min。
6) 4000rpm×3min 离心。
7) 留100ul 上清，弃多余部分，混匀，涂布到含氨苄青霉素的LB 板(预先涂
布X-gal 和IPTG)。
8) 37℃ 培养箱倒置培养过夜，约16 小时。
2.6 基因克隆实验中接菌
1） 转化得到蓝白菌落筛选板 (因为我们一般用的是PGEM-T 做连接，经X-gal处理后，有插入片段的显白色；载体自连的显蓝色，因此得到筛选。)；
2） 挑取白色的菌落接到含氨苄青霉素的LB 培养基；
3） 37℃，260rpm 培养；
4） 培养5-6 小时后挑取2ul 菌液为模板做PCR 鉴定；
5） 以PCR 结果，将有目的片段插入的样品以5ml LB 培养基再次接菌，37℃，260rpm 培养过夜，约16 小时。
2.7 阳性克隆鉴定 (PCR 鉴定)
2.7.1PCR 鉴定体系
10X Taq buffer 3 ul
4X dNTP (10mM) 0.5 ulTaq DNA polymerase(5U/ul) 0.2ul(1U)10uM引物 (双向) 各1ul50%DMSO(which is optional) 1ul
模板：过夜菌液 / 挑单克隆 2ul加灭菌水至 30ul
2.7.2 PCR 鉴定程序：
94℃ 5min
94℃ 30s
30cycle 55℃ 30s
72℃ 3min
72℃ 10min
4℃ +∞
30ul 上样，走电泳(以100bp plus marker 为对照)→核对片断大小
2.8 质粒抽提 (质粒小量抽提试剂盒)
1) 收菌 以10000 rpm ×1 min 离心收菌。(一般抽提一份用3-4ml 菌液)
2) 弃上清。
3) 加100ul 冰浴Solution I(含Rnase A)，涡旋振荡，使菌体充分悬浮。
4) 加200ul Solution II，温和混匀6 次。(此过程不超过5min)
5) 加280ul Solution III，温和混匀6 次。
6) 以14000 rpm×10 min 离心。
7) 取上清，过吸附柱，以10000 rpm×1 min，弃滤液。
8) 吸附柱内加450ul Buffer2，10000 rpm×1 min，弃滤液。
9) 反复步骤8)一次。
10) 14000 rpm×1 min 离心。
11) 将吸附柱旋转180 度后再14000 rpm×1 min 离心。
12) 加40ul 50℃预热的ddH2O(或EB buffer)于吸附柱的膜中央，室温静置
2min。
13) 14000 rpm×1 min 离心并收集洗脱液，即质粒DNA。
2.9 基因克隆基因测序
1) ABI377 测序仪测序。
2) 测序结果分析：用软件Vector NTI Suite 6 分析测序结果。每个克隆相应的测序结果，分析结果，存储信息分类输入数据库http://192.168.0.2/index.htm。克隆信息管理系统。将测序完成的克隆编号入库。
3. 基因克隆的编码
根据实验基因引物的号码相对应编制。
如：基因引物编号： 1000_f 1000_r
克隆编号： 1000A1 or 100092
(注：号码倒数第二位为日期编号： 1—9 为阿拉伯数字 10=A,11=B,12=C…最后一位为克隆数编号，一般为1—3)
