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染色质免疫共沉淀（ChIP）实验
Release Time：2020-07-07染色质免疫共沉淀（ChIP）
一、实验原理
在保持组蛋白和DNA结合的同时，通过使用对应于特定组蛋白标记的生物抗体，将染色质切成小块并沉淀。
IP是通过利用抗原蛋白和抗体的特异性结合以及特异性结合免疫球蛋白的FC片段的细菌蛋白的“蛋白原A”现象开发的方法。
目前，将精制的蛋白A在蛋白琼脂糖珠上预混合并固化，然后与溶液和含有抗原的抗体反应，珠上的蛋白A可以吸附抗原，达到纯化的目的。
ChIP芯片技术的发展为分析活细胞或组织中DNA与蛋白质之间的关系提供了极为强大的工具。在将来的研究中，将改进芯片的结构以提高其实用性。容易获得的抗体的使用增加了该方法的可用性。
在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP(其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip(其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。
二、实验材料：细胞样本
试剂、试剂盒：甲醛、 甘氨酸 、PBS 、SDS 、Lysis Buffer 淋洗液 、RNaseA 、蛋白酶K 、欧米茄胶水回收套件
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS号 | 备注 |
| 1 | 甲醛 | CCF10222 | 349149-07-1 | |
| 2 | 甘氨酸 | SS3763 | 56-40-6 | |
| 3 | SDS | SS0013 | 151-21-3 | |
| 4 | RNaseA | HC1333 | ||
| 5 | 蛋白酶K | SS2244 | 39450-01-6 | |
| 6 | 1000ul蓝吸头1000ul Pipet Tips | FT-1000 | ||
| 7 | 200ul黄吸头 | FT-200 | ||
| 8 | 2ml圆底连盖离心 | F-EP020 |
三、仪器，耗材: 离心管 超音波 电泳法 离心机
四、实验程序
（1）.甲醛交联和超声破坏细胞(第一天）
1.取出1板细胞(10厘米板），并添加243 ul 37％甲醛，使甲醛终浓度为1％(共9毫升培养基）。
2.在37°C下孵育10分钟。
3.终止交联：在培养皿中加入甘氨酸至终浓度0.125M。450ul 2.5 M甘氨酸。混合后，在室温下静置5分钟。
4.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤细胞两次。
5.用刮刀将细胞收集在15 ml离心管中(PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷却后，以2 000 rpm收集细胞5分钟。
6.倒出上清液。根据细胞数量，添加SDS Lysis Buffer。最终细胞浓度为每200ul 2x106个细胞。每100 ul溶液中包含1x106个细胞。然后添加蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7杂草丛生的板是5x106个细胞。这次细胞生长到大约80％。那是4x106个单元。因此，在每个试管中加入400 ul SDS裂解缓冲液。将2个试管混合在一起，总共800 ul。
7.超声波破碎：VCX750，25％功率，冲击4.5 s，间隙9 s。共14次。
（2）去除杂质并培养抗体(第一天）
1.超声破碎后，在4℃以10000 g离心10分钟。除去不溶物。
2.留300ul用于实验，其余的保存在-80℃。
3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
4.将100ul的ChIP DilutionBuffer和20ul的50xPIC加入到100ul超声破碎的产品中。分别添加60ul蛋白A琼脂糖/鲑鱼精子DNA。在4°C下翻转并混合1小时。
5. 1小时后，在4°C静置10分钟以沉淀并以700 rpm离心1分钟。
6.取上清液。每个输入20 ul作为输入。在一个试管中加入1ul抗体，在另一支试管中不加入抗体。在4°C过夜过夜。
（3）测试超声波破碎的效果(第一天）
1.取100 ul超声压碎的产品，加入4 ul 5M NaCl，在65℃下处理2小时以解交联。
2.分离一半并用苯酚/氯仿萃取。电泳检测超声效果。
（4）免疫复合物的沉淀及清洗(第二天）
1.孵育过夜后，向每个试管中添加60 ul Protein A琼脂糖/鲑鱼精子DNA。在4°C下翻转2小时。
2.在4°C放置10分钟后，以700 rpm离心1分钟。除去上清液。
3.依次用以下溶液洗涤沉淀的化合物。清洁步骤：添加溶液，在4°C下颠倒10分钟，在4°C下静置10分钟以沉淀，以700 rpm离心1分钟，除去上清液。
4.洗涤液：
①low salt wash buffer-one wash
②highsalt wash buffer-one wash
③LiCl wash buffer-one wash
④TE buffer-two wash
5.清洗后，将开始洗脱。淋洗液的配方：100 ul 10%SDS，100 ul1M NaHCO3，800 ul ddH2O，共1 ml。每管加入250 ul洗脱buffer，室温下颠转15 min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的淋洗液为每管500 ul。
6. 解交联：每管中加入20 ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M）。充分混合，并在65°C下脱交联过夜。五、DNA样品的回收(第三天）
1. 解交联结束后，每管加入1 ul RNaseA(MBI），37℃孵育1 h。
2. 每管加入10 ul 0.5 M EDTA，20 ul1M Tris.HCl(PH6.5），2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃处理2 h。
3. DNA片段的回收----欧米茄胶水回收套件。最终的样品溶于100 ul ddH2O。
