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PCR-SSP分析实验
Release Time：2020-07-06PCR-SSP分析实验
一、实验简介
PCR序列特异性引物（SSP）分析方法是通过使用可以特异性鉴定特定等位基因的引物通过PCR扩增来检测序列多态性的方法，也称为等位基因特异性引物PCR方法。本实验采用PCR-SSP法检测MN的基因型。
二、实验方法原理
根据确定的某个等位基因的性质，设计其3'端第一个碱基与每个等位基因的特定碱基匹配的序列特异性引物。在PCR反应期间，只有引物3'末端。只有当第一个碱基与确定特定等位基因的碱基互补时，DNA片段才能完全复制，并且根据PCR产物的存在或不存在对等位基因进行分型。
三、实验材料
PCR扩增仪，
电泳仪，
电泳槽，
引物1：5'-GCATCAAGTACCACTGGT-3'；
引物2：5'-GCATTAAGTACCACTGAG-3'；
通用引物：5'-GAGAAGTTGAGAAAGGGGT-3'。
模板DNA，
Taq聚合酶，
丙烯酰胺，
电极缓冲液，
加载缓冲液等
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAC | 备注 |
| 1 | 丙烯酰胺 | LSH54449 | ||
| 2 | IEF电极缓冲液 | HC1773 |
四、实验程序
1.PCR扩增PCR反应系统为20μl（2个系统，分别为引物1和引物2），包含模板2μl（约50ng），引物1.5μl，dNTP1.6μl（0.4mM），10×缓冲液2μl， Taq酶1.0 U，加双蒸水至20.0μl; PCR反应条件为94℃4min，94℃1.5min / 52℃2.0min / 72℃2.0min，30个循环。
2.PCR扩增产物的检测取2μlPCR扩增产物，进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳（T = 6％，C = 3.3％，凝胶规格为82mm×64mm×0.75mm）。电极缓冲液为1×TBE。将添加有1/5体积上样缓冲液的消化产物在220 v电压下电泳2至3小时。银染显色。
五、结果判断
根据电泳条带的等位基因类型的确定，只有一个系统将该条带检测为对应的特定引物的对应类型（M或N），并且两个系统都将该条带检测为MN类型。
六、实验讨论
1.注意事项①如果引物结合序列存在碱基变异，则可能没有扩增产物，导致类型判断错误； ②只有根据对照样品的准确分类，才能判断结果。
2.方法评估该方法操作简便，并且需要较高的复性条件才能进行引物设计和实验。
