丝状肌动蛋白特异性探针,Factin-488 probe

丝状肌动蛋白特异性探针-Factin probe的光学数据

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一、染色液的配置
1. 母液配置
1) 使用前将本品回温至室温，简短离心后，加入30μL DMSO充分溶解，混匀后即可获得1000×Factin-488 probe母液。
2) 根据实验需求分装母液，置于-20℃避光干燥保存，避免反复冻融影响效果。
2. 工作液配置
吸取1μL上述1000×母液，加入1mL含1% BSA的1×PBS缓冲液中，混匀后得到1×工作液。
【注意】：不同细胞的染色效果存在差异，可根据实际实验情况，微调Factin-488 probe的使用量。

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二、染色步骤（以细胞爬片为例）
1. 细胞爬片培养≥24h，使细胞密度达到50~60%汇合度（保证细胞形态良好，便于观察）。
2. 吸弃培养液，用37℃预热的1×PBS（pH 7.4）清洗细胞2次，每次轻柔操作，避免冲散细胞。
3. 加入溶于PBS的4%多聚甲醛固定液，室温固定10~30min。
【注意】：固定剂中禁止含有甲醇，甲醇会破坏肌动蛋白（F-actin）结构，导致染色失败。
4. 室温条件下，用1×PBS清洗细胞2~3次，每次10min，彻底洗去残留固定液。
5. 室温条件下，用预冷（≤-20℃）丙酮脱水，或用0.5% Triton X-100溶液（溶于PBS）透化细胞5min，使探针能穿透细胞膜。
6. 室温条件下，用1×PBS清洗细胞2~3次，每次10min，洗去残留丙酮或透化液。
7. 每孔（96孔板）加入100μL配制好的1×工作液，确保工作液完全覆盖盖玻片上的细胞，室温避光孵育30min（4℃~37℃孵育均可，可根据实验条件调整）。
【注意】：① 为降低染色背景，可在工作液中额外添加1% BSA；② 孵育过程中需将盖玻片置于密封容器内，防止工作液挥发。
8. 用1×PBS清洗盖玻片3次，每次5min，洗去未结合的探针，减少背景荧光。
9. 每孔（96孔板）加入100μL即用型DAPI溶液（浓度100nM），对细胞核进行复染，孵育约30s即可。
10. 用1×PBS快速清洗盖玻片1次，将盖玻片倒置在已滴有1滴Fluoromount-GTM水溶性封片剂（不含DAPI）的载玻片上；用纸巾轻轻擦去多余封片剂，再用透明指甲油永久封片。
11. 封片后的标本可置于4℃避光保存，6个月内可正常进行F-actin染色分析；观察时使用荧光显微镜或共聚焦显微镜，选择FITC激发/发射滤片（Ex/Em=496/516nm）观察F-actin（绿色荧光），选择DAPI激发/发射滤片（Ex/Em=364/454nm）观察细胞核（蓝色荧光）。

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三、实验需自备材料
1. 甲醇（可选，用于部分实验场景）
2. 1×PBS缓冲液（pH 7.4，细胞培养级别，用于清洗、配制试剂）
3. 固定液：4%多聚甲醛（溶于1×PBS缓冲液，无甲醇成分）
4. 透化/脱水试剂：预冷丙酮（≤-20℃）或0.5% Triton X-100溶液（溶于1×PBS缓冲液）
5. 封片及复染试剂：Fluoromount-GTM水溶性封片剂（不含DAPI）、即用型DAPI溶液（浓度100nM）；或直接使用含DAPI的Fluoromount-GTM水溶性封片剂
6. BSA（标准级别，用于配制工作液、降低染色背景）
7. 载玻片、盖玻片（细胞爬片专用，提前灭菌处理）
8. 盖玻片密封液：透明指甲油
9. 成像仪器：装配有FITC激发/发射滤片和DAPI激发/发射滤片的荧光显微镜或共聚焦显微镜

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四、注意事项
1. 探针单位定义：1个单位（T）的Factin-488 probe，按推荐工作液浓度200nM、每次用量100μL计算，可检测300次；按工作液浓度100nM、每次用量200μL计算，同样可检测300次。
2. 鬼笔环肽具有毒性，实验操作时需佩戴手套、口罩，小心操作，避免皮肤接触、吸入或误食；实验结束后及时清理实验台面，妥善处理废液、废料。
3. 本品为冻干粉形式，微量不易观察，使用前需瞬时离心（将冻干粉收集至管底），加入指定溶剂溶解后再使用；溶解后溶液接近无色，属于正常现象。
4. 全程需注意避光操作（Factin-488 probe荧光基团对强光敏感），包括试剂配制、细胞孵育、标本保存及成像，避免荧光淬灭导致成像效果不佳。
5. 所有试剂均需保证无菌、无杂质，避免污染细胞或影响探针结合效率；PBS缓冲液需调节至pH 7.4，偏离该范围可能影响染色效果。

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