Cal-520 AM钙离子荧光探针

Cal-520 AM钙离子荧光探针使用方法推荐:
1. 带有 Cal-520®,AM 的称重传感器：
AM 酯是非极性酯，可以很容易地穿过活细胞膜，并被活细胞内的细胞酯酶迅速水解。 AM 酯广泛用于将各种极性荧光探针无创地加载到活细胞中。但是，使用 AM 酯时必须小心，因为它们容易水解，尤其是在溶液中。它们应在使用高质量无水二甲基亚砜 (DMSO) 前重新配制。 DMSO 储备溶液可在 –20 °C 下干燥保存并避光。在这些条件下，AM 酯应能稳定数月。以下是我们推荐的将 Cal-520® AM、Cal-590™ AM 或 Cal-630™ AM 酯装入活细胞的方案。本协议仅提供指导方针，应根据您的具体需求进行修改。
a) 在高质量无水 DMSO 中制备 2 至 5 mM Cal-520® AM 储备溶液。
b) 在实验当天，将 Cal-520® AM 溶解在 DMSO 中或将等分的指示剂储备溶液解冻至室温。在 Hanks and Hepes 缓冲液 (HHBS) 或您选择的含有 0.04% Pluronic® F-127 的缓冲液中制备 10 到 20 µM 的染料工作溶液。细胞加载所需的指示剂的确切浓度必须凭经验确定。
注意：非离子洗涤剂 Pluronic® F-127 有时用于增加 Cal-520® AM 的水溶性。
c) 如果您的细胞（例如 CHO 细胞）含有有机阴离子转运体，则可以将丙磺舒 (1-2 mM) 添加到染料工作溶液中（最终孔浓度为 0.5-1 mM）以减少染料泄漏脱酯指示剂。
d) 将等体积的染料工作溶液（来自步骤 b 或 c）添加到您的细胞板中。
e) 将染料加载板在细胞培养箱中孵育 60 至 90 分钟，然后在室温下再孵育 30 分钟。
注意：孵育染料超过 2 小时可为某些细胞系提供更好的信号强度。
f) 用 HHBS 或您选择的包含阴离子转运蛋白抑制剂（例如 1 mM 丙磺舒）的缓冲液替换染料工作溶液，以去除多余的探针。
g) 在 Ex/Em = 490/525 nm（对于 Cal-520® AM）、540/590 nm 下运行实验
2. 测量细胞内钙反应：

图 1. 没有丙磺舒的 CHO-M1 细胞中内源性 P2Y 受体对 ATP 的反应。 CHO-M1 细胞以每孔 40,000 个细胞每孔 40,000 个细胞接种在 96 孔黑壁/透明底部肋板中过夜。 将 100 µl 4 µM Fluo-3 AM、Fluo-4 AM 或 Cal 520® AM 的 HHBS 溶液加入孔中，并将细胞在 37 °C 下孵育 2 小时。 将染料加载介质替换为 100 µl HHBS，加入 50 µl 300 µM ATP，然后使用 FITC 通道在荧光显微镜（Olympus IX71）上成像。

图 2. 使用 Cal-520® 或 Fluo-4 AM 测量的 CHO-K1 细胞中内源性 P2Y 受体的 ATP 刺激钙反应。 CHO-K1 细胞以每孔 50,000 个细胞每孔 50,000 个细胞的形式接种在 96 孔黑壁/透明底部肋板中过夜。 将 100 µL 5 µM Fluo-4 AM 或 Cal-520® AM（含（A）或不含（B）2.5 mM 丙磺舒）加入细胞中，并将细胞在 37oC 下培养 2 小时。 由 FlexStation（Molecular Devices）添加 ATP（50 µL/孔）以达到最终指示浓度。

图 3. CHO-K 细胞中内源性 P2Y 受体对 ATP 的反应。 CHO-K 细胞以每孔 40,000 个细胞每孔 40,000 个细胞接种在 96 孔黑壁/透明底部肋板中过夜。 将 100 µl 含 1 mM 丙磺舒的 HHBS 中的 4 µM Cal 590™ AM 或 Cal 630™ AM 加入孔中，并将细胞在 37 °C 下孵育 2 小时。 用 100 µl HHBS 和 1 mM 丙磺舒替换染料加载培养基，然后在加入 50 µl 300 µM ATP 之前和之后使用 TRITC 通道在荧光显微镜（Olympus IX71）上成像。