活死细胞双染试剂盒

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Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒 荧光特性：
Calcein-AM : λex=490 nm , λem=515 nm
PI : λex=530 nm , λem=580 nm

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Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒 染色案例：

                                                                           细胞染色实例

         

              （a）                                     （b）                                      （c）

1. Calcein-AM染FTC细胞（活细胞单染）
2.  PI染HCT116细胞（死细胞单染）
3. Calcein-AM、PI染MHD-1 细胞（活死细胞双染）

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Calcein-AM/PI 最适浓度:
由于不同细胞种类、细胞浓度的染色条件不同，我们建议自行摸索一下Calcein-AM和PI的最适浓度。
Calcein-AM和PI的最佳浓度是根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度：
1. 通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中培养10 min或通过在70%乙醇中培养30 min制备死细胞。
2. 用0.1-10 μM PI溶液染死细胞，以便找到仅针对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。
3. 用0.1-10 μM Calcein-AM溶液染死细胞，以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度，再以此浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞是否被染色。

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Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒 实验步骤
以HeLa细胞为例
制备1 mmol/l的Calcein-AM储存液
【500 次】
将200 μl DMSO加入到含200 μg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。
【3000 次】
将1 ml DMSO加入到含1 mg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。
※Calcein-AM储存液需要避光，在-20℃密封保存。

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使用方法
1. 工作液的配制
1.1 1×Assay Buffer（反应缓冲液）的配制
从低温冰箱内取出10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水（dH2O）做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。
注意：低温情况可能有析出现象，可在室温情况下摇匀使用。
1.2 1×染色工作液的配制
1）先将低温保存的Calcein-AM溶液 (2 mM)和PI溶液（1.5 mM）回到室温20-30 min。
注意：第一次使用可对母液进行分装，以减少反复冻融次数。 注意：由于Calcein-AM的稳定性比较差，此染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
2. 染色步骤
2.1  对于贴壁细胞，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞，之后离心收集细胞（1000 rpm，3 min）。
对于悬浮细胞，直接离心（1000 rpm，3 min）收集细胞。
2.2  去上清，用1×Assay Buffer充分清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酯酶活性。
2.3  用1×Assay Buffer制备细胞悬液，使其密度为1×105~1×106细胞/mL。
2.4  取100 µL染色工作液加入200 µL细胞悬液内，混匀，37℃孵育15 min。
注意：如果需要，可延长孵育时间至30min。
2.5  荧光显微镜下使用490±10 nm激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545 nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。
注意：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。
a）用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育细胞10 min，或者用70%乙醇孵育细胞30 min，从而制备死细胞；
b）用0.1-10 µM的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
c）用0.1-10 µM的Calcein-AM进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。

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实验注意事项
1、 由于本试剂盒中的Calcein-AM Reagent 粉末和PI Stock Solution量很少，有可能会粘在盖子或管壁上，开封前请先涡旋以使其振落下来。
2、 由于Calcein-AM储存液对潮气敏感，请在使用后密闭Calcein-AM储存液的盖子。如果不能一次用完，建议分装保存，例如分装成10 μl/管，用封口膜封口，并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。
3、 配制好的染色工作液请在当天使用。
4、 PI有疑似致癌性，使用前应注意以下几点：
a.使用时请带好手套，口罩，防护眼镜等，不要接触到或呼吸到。
b.当PI不慎接触到皮肤时，请立刻用大量的水冲洗。
c.处理方法
清洗容器的清洗液和废液请按照实验室的有毒有害物质的处理方法进行处理，或按照以下方法处理：
用UV照射的方法进行分解
用次氯酸钠氧化分解后，进行中和处理

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