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提取病毒RNA的实验方法
Release Time：2020-07-22一、病毒RNA提取方法介绍
二、提取病毒RNA的实验试剂和耗材
| 序号 | 产品 | CAS号 | 货号 | 备注 |
| 1 | 异硫氰酸胍 | 593-84-0 | SS4104 | |
| 2 | 异丙醇 | 67-63-0 | JT25997 | |
| 3 | 氯仿 | 865-49-6 | DD0008 | |
| 4 | 乙醇 | 64-17-5 | JT26000 | |
| 5 | 焦碳酸二乙酯（DEPC） | 1609-47-8 | JT22499 | |
| 6 | 1.5ml灭菌离心管 | F-EP015-H |
三、异硫氰酸胍的提取病毒RNA的实验步骤
1.取200ul样品+阴性对照+阳性对照，加入1.5ml无菌范德生物离心管；
2.加入600ul异硫氰酸胍，然后加入对照和样品，再加入200ul氯仿，颠倒混合；
3.以13000rpm离心15分钟；
4.离心第三步结束时，取相同数量的1.5ml无菌范德生物离心管，并加入在-20℃预冷的400ul异丙醇。
5.从离心第三步中取出上清液（确保不要吸收中间的白色层，并且在离心第三步后取出试管时，不要倾斜试管），将其转移到准备好的试管中在第4步中，将其倒置混合；
6.以13000rpm离心15分钟，轻轻倒出上清液，并在吸水纸上尽可能干燥液体。
7.加入600ul的75％乙醇，并颠倒数次，以洗涤剩余的异丙醇；
8.以13000rpm离心15分钟，轻轻倒入上清液，并尝试在吸水纸上干燥液体。
9.以4000rpm的速度离心10秒，将管壁上的剩余液体摇至底部，用微量移液器吸头，并在室温下干燥2-3分钟（不要太干以防止RNA不溶于下一步）;
10.加入20ul DEPE水（在高压下加入depc纯水后的水为DEPE水），轻轻混合以溶解RNA。以2000rpm的速度离心5秒，然后保存在冰上备用（最好在2小时内使用以避免RNA降解）。
四、TRIzol LS提取病毒RNA方法
提取物是血清，血液，细胞培养液，鸡胚尿囊液和其他液体中的病毒。应在人少的情况下进行提取，以防止空气中RNase的污染。所用的一切也应不含RNase。
1.将500ul病毒原液加入1.5ml范德生物离心管中，然后加入500ul TRIzol LS，充分混合，然后在室温下放置10分钟；
2.加入200ul氯仿，盖上离心管盖，用力摇晃离心管（溶液已完全乳化，呈乳白色，无相分离现象），并在室温下放置10分钟（因为氯仿具有沸点低且易挥发，摇动离心管可能会破裂（小心）；
3.在4°C下以13000r / min的转速离心15分钟，吸收上层液相并将其转移到另一个试管中（不要抽吸白色中间相）；
4.加入等体积的异丙醇，轻轻倒转离心管以充分混合液体，然后在室温下放置10分钟；
5.以13000r / min在4℃离心15分钟。 （乍看之下，您会发现试管中什么也没有。如果仔细观察，您会发现试管底部附近的壁上有白色沉淀物。）小心吸掉所有上清液；
6.用1ml的75％乙醇洗涤，在4℃以8000r / min的速度离心10min，（然后您会发现试管再次是空的，不用担心，有，但是因为量太小，您看不到）。干净，在超干净的台中干燥5分钟；
7.加入适量的DEPC处理水。 （如果材料来源丰富，则添加的水量是下一步RT的总量减去其他试剂的量；如果要节省使用量，您可以自己动手做，尽量不要添加过多水）;
8.建议立即进行RT。如果要储存，则可以在上一步中添加乙醇后将其冷冻在-70°C下，并且可以保存一年；如果添加DEPC水，则只能在-20°C下保存约1个月。
五、Trizol提取病毒RNA方法（提取禽流感病毒的步骤供参考）
Trizol方法适用于人类，动物，植物以及微生物的组织或细菌培养。一般选择样品量可以从几十毫克到几克不等。
1.取鸡胚尿囊液，加入5-10倍体积的Trizol液，然后搅拌均匀；
2.在室温条件下放置大约5分钟，然后以每1毫升Trizol溶液0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇动离心管15秒钟；
3.将上层水相放入新的离心管中，以每毫升Trizol溶液0.5毫升异丙醇的比例添加异丙醇，在室温下放置10分钟，然后在12000克下离心10分钟；
4.弃去上清液，每毫升Trizol溶液加入至少1ml的75％乙醇，充分混合，并在4°C下以7500g离心5分钟；
5.重复步骤4；
6.小心丢弃上清液，然后在室温下干燥5-10分钟。注意不要将其过度干燥，否则会降低RNA的溶解度。
7.然后将RNA溶解在水中，静置10分钟。
六、提取病毒RNA实验的注意事项
1.在整个实验操作过程中，请戴好口罩和一次性手套，并尽可能降低操作强度；
2.加入氯仿前的匀浆可以在-70°C条件下保存约1个月以上，在70％乙醇中沉淀的RNA可以在4°C下保存1周，在-20°C下保存1年。
