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酵母菌落PCR方法
Release Time：2020-07-16一、实验介绍
我检查了一些数据，说使用反复的冻融方法，直接挑出单个菌落就足够了吗？也有人说蜗牛酶被用来帮助消化。我对此不太清楚，所以请帮助大虾。现在我真的为此受了伤！
答：蜗牛酶提取DNA后，PCR效果非常稳定
二、酵母DNA的提取
| 序号 | 产品 | CAS号 | 货号 | 备注 |
| 1 | PH标准缓冲溶液(PH=7.00±0.02) | HC1482 | ||
| 2 | 磷酸盐-SDS电泳缓冲液 | HC1305 | ||
| 3 | 乙酸钾 | 127-08-2 | JT0883 | |
| 4 | 无水乙醇 | 64-17-5 | JT26000 | |
| 5 | 异丙醇 | 67-63-0 | JT25997 | |
| 6 | 酚氯仿 | 865-49-6 | JW0132 | |
| 7 | 0.9mol/l 山梨醇 | 50-70-4 | SS0003 | |
| 8 | 50mmol/l Tris | 77-86-1 | SS1426 | |
| 9 | 50ml插口离心管 | F-EP500-C | ||
| 10 | YEPD培养基 | HC0991 |
1.向新鲜细菌中加入150ul（200ul）i25（30）ul蜗牛酶（30mg / ml），于37度，10分钟（30分钟水浴，间隔5分钟，摇晃一次），以避免细胞沉到底部管。
2. 10000rmp离心10min，除去上清液，在沉淀物中加入缓冲液I250ul
3.添加25ul 10％SDS。 65度，30分钟水浴。
4.加入25ul 5mol / lKAC，冰浴60分钟（可放置4度冰箱）
5. 12000rmp，15分钟，取上清液，在上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，混合并在-20度下放置一小时（可以过夜，取出后不要摇晃，直接离心）
6. 12000rmp，15min，弃去上清液。
7. 150ul，BufferIII溶液沉淀，12000rmp，15min
8.将上清液转移到干净的离心管中，加入6ul（10ug / ul），运行酶，37度，30min
9.加入等体积的异丙醇，在4度下静置10min，10000rmp，5min，溶于50ulbufferIII
10.如果有蛋白质，可以用苯酚氯仿萃取
11.缓冲液I：0.9mol / l山梨糖醇，0.1mol / l EDTA
12. bufferII：50 mmol / l Tris，20 mmol / l EDTA
13.缓冲液III：10mmol / l tris，1mol / l EDTA
14.筛查AD / BD可直接使用抗生素筛查方法
三、酵母菌落PCR
1.酵母质粒的制备和基因组DNA PCR模板
取对数生长期的酵母菌株1.5ml，13000r / min，离心15s，除去上清液，用双蒸馏水洗涤一次，以13000r / min离心15s，将沉淀悬浮于200ulTE缓冲液中，煮沸1-10min。水，冰浴10min，13000r / min，离心5min，将上清液保存在-20度，取1ul进行PCR
2.从培养皿中取出几个生长良好的菌落，并将其悬浮在装有20ul无菌水的0.5ml eppendofff离心管中（预先用注射器针头将离心管的中心打一个小孔，盖上盖子）由于热而膨胀）。将水浴煮沸0.2。 5.10分钟
3.使用微波炉快速准备酵母处理剂和菌落。取一个直径大于3mm的干燥酵母菌落。盖上EP管的盖子，在微波炉中加热，以30ulTE摇动，13000r / min，离心2-5min，上清液储存浴-20度，取1ul用于PCR
四、真菌DNA提取方法的改进
1.激活酵母后，添加YEPD培养基并在25-28度下孵育16-24小时以收集细菌
2.取少量新鲜细胞，并加入0.6ml 1ml缓冲液I（0.9mol / l山梨糖醇，0.1mol / l EDTA）。 0.1ml蜗牛酶（30mg / ml），37度温水浴60分钟
3.以3000 r / min的速度离心10 s，除去上清液，将沉淀物添加到150 mmol / l Tris，20 mmol / l EDTA 1 ml，10％SDS 0.1 ml 65度的缓冲液II中，水浴30分钟。
4.加入0.3ml，5mol / l KAC冰浴60分钟
5. 10000rmp，15分钟，取上清液，在上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，混合并在-20度下放置一小时（可以过夜，取出后不要摇晃，直接离心）。 5000-6000r / min离心15s
6.用0.6ml缓冲液III10mmol / l tris，1mol / l EDTA沉淀以溶解1000r / min，离心15分钟
7.将上清液转移至干净的离心管中，加入6ul10ug / ul），在37度下运行酶30分钟
8.加入等体积的异丙醇，在4度下静置10min，10000rmp，5min，溶于50ulbufferIII
9.如果有蛋白质，可以用苯酚氯仿萃取
五、后续实验测试思路
1.提取酵母DNA
2.做PCR
筛选库的引物（在CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC上
下一个：GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT
由于该引物的TM值高，因此必须使用二级PCR
94度，3分钟，95度，20米，68度3分钟，68度7分钟，15度15分钟
修改程序94度，3min，95度，25miao，50度25miao，72度1min30s，72度5min
4.用T和B消化（65度消化）
Taq I（AGCT）、10 * Taq I基础缓冲、0.1％bsa、PCR产品、消毒水、酵素、BsuRI（GGCC）、R缓冲模版、消毒水、酵素
5.分开不同的部分
6.将DNA转移到大肠杆菌中，然后提取质粒，测序或使用抗生素筛选AMP，获得AD和假名获得BD
