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非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(实验简介,工作液准备,实验方法,实验操作,实验问答)
Release Time：2020-07-09一、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳简单介绍：
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）用于在不添加变性剂（例如SDS乙醇）的情况下对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，这通常用于鉴定和纯化同工酶。无需SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子保持电泳过程中的自然形状和电荷。它们的分离是基于它们不同的电泳迁移率和凝胶的分子筛作用，因此可以得到高分离度，尤其是在电泳分离后，仍可以保持生物大分子（例如蛋白质和酶）的生物活性，这具有很大的意义。该方法是对凝胶上的两个相同样品进行电泳。电泳后，将凝胶切成两半，一半用于主动染色以识别特定的生物大分子，另一半是用于对所有样品进行染色以分析样品中各种生物大分子的类型和含量。二、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验方法：
非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳的操作基本相同，但是非变性聚丙烯酰胺凝胶和电泳缓冲液的制备不能包含SDS等变性剂。
通常，应通过非变性凝胶电泳将蛋白质与碱性或酸性蛋白质区分开。分离碱性蛋白质时，请使用低pH凝胶系统；分离酸性蛋白质时，请使用高pH凝胶系统。
酸性蛋白质通常用于非变性凝胶电泳中。缓冲液系统的pH值为8.8。蛋白质将带负电荷，并且蛋白质将与阳极一起移动；而碱性蛋白通常在弱酸性环境中进行电泳，并且该蛋白带正电。此时，有必要将阴极和阳极反转以电泳分离酸性蛋白质。
| 序号 | 名称 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | Tris-HCl，pH 8.8 | SS6165 | ||
| 2 | Acr：Bis = 29：1 | SS6101 | ||
| 3 | 甘氨酸 | SS3763 | ||
| 4 | 2×溴酚蓝 | SX0029 | 115-39-9 | |
| 5 | 甲醇 | JT25999 | 67-56-1 | |
| 6 | 甘油 | JT26018 | 56-81-5 |
三、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳工作液准备：
1.40％凝胶储备溶液（Acr：Bis = 29：1）;
2.4×分离缓冲液（1.5M Tris-HCl，pH 8.8）：将18.2g Trisbase溶于ml水中，用浓HCl将pH调节至8.8，加水使体积达到100ml，并在4℃下保存；
3. 4×Bulk Gel Buf（0.5 M Tris-HCl，pH 6.8）：将6g Trisbase溶于80ml水中，用浓HCl调节pH值至6.8，加水使体积达到100ml，在4℃下保存；
4.10×电泳缓冲液（pH8.8 Tris-Gly）：30.3 g Trisbase，144 g甘氨酸，加水至L的体积，在4℃储存；
5.2×溴酚蓝负载Buf：1.25ml pH6.8，0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5％溴酚蓝，5.5ml dH2O;储存于-20℃；
6. 10%APS;
7. 0.25％考马斯亮蓝染色液：考马斯蓝R-250 2.5g，甲醇ml，HAc 100ml，dH2O 450ml；
8.考马斯亮蓝脱色溶液：100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O
电泳凝胶的制备和电泳条件（上电极为负极，下电极为正极）：
1.碱性非变性胶17％分离胶（10毫升）4％累积胶（5毫升）
2. 40％凝胶储备溶液（40％T，3.3％C）4.25ml 0.5ml
3. 4×分离缓冲液（1.5 M Tris-HCl，pH 8.8）2.5ml
4. 4×Bulk Gel Buf（0.5 M Tris-HCl，pH 6.8）1.25ml
5.水3.2ml
6. 10%APS 35ul
7. TEMED 15 ul
8. 10×电泳缓冲液（pH8.8 Tris-Gly）：100 ml稀释至L
电泳条件：100V恒压约20min，指示剂进入浓缩凝胶；改变160V恒压，当指示器移至橡胶板底部时，停止电泳，整个过程约为80min。
染色和脱色：取出橡胶板，在0.25％考马斯亮蓝色染色液中染色约30min，倒出染色液，加入考马斯亮蓝色脱色溶液，缓慢摇动，注意更换脱色溶液，直至橡胶板干净整洁的背景。它也可以用于银染或反应性染色。
碱性蛋白的分离：
要使用低pH凝胶系统，请使用以下缓冲液系统：
1.分离凝胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7％T，2.67％C）；
2.堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125％T，25％C）；
3.电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5
使用甲基绿（0.002％）作为示踪剂将正极和负极反转
四、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验操作与酸性蛋白质的分离相同：
回收：
本机PAGE完成后，将电泳方法用于回收，电泳完成后，切掉一部分染色，然后根据染色结果切下含蛋白质的胶带，将其装入处理过的透析袋中，加入适量的缓冲液，最后将透析袋放入普通核酸中酸性电泳槽，将其放入电泳槽中。添加适量的缓冲液（与透析袋中的缓冲液相同），并在低温下运行2-3小时。用于蛋白质回收的缓冲液通常与用于电泳的缓冲液相同。
SDS-PAGE和Native-PAGE的比较：
非变性凝胶电泳，也称为天然凝胶电泳，与非变性凝胶电泳的最大区别在于蛋白质在电泳期间和之后均不会变性。最重要的是：
1.在凝胶的配置中，不能将SDS添加到未变性的凝胶中，但是将SDS用于变性的凝胶。
2.电泳样品上样缓冲液中的非变性凝胶没有SDS或巯基乙醇。
3.非变性凝胶中蛋白质的分离取决于电荷和分子大小。与SDS-PAGE电泳不同，蛋白质分离仅与其分子量有关。
4.在非变性凝胶电泳中，酸性蛋白质和碱性蛋白质的分离是完全不同的，这与SDS-PAGE中所有蛋白质都向正极游动的蛋白质不同。在非变性凝胶电泳中，碱性蛋白质通常呈弱酸性。在这种环境下，蛋白质带正电，电泳前阴极和阳极需要颠倒。
5.由于是非变性凝胶电泳，因此在所有电泳过程中电流都不应过大，以免在电泳过程中产生过多热量而导致蛋白质变性，并且步骤必须在0-4度下进行，从而可以维持蛋白质。活性还可以减少蛋白质水解。这与变性电泳不同。
因此，与SDS-PAGE电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性的可能性。
五、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验问题和解答：
1.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中的预电泳问题是什么？电泳前是否需要添加6×DNA上样缓冲液？电泳1-2小时后是否需要添加结合反应产物？
电泳前要去除未在凝胶中聚合的单体和二聚体以及聚合引发剂，以提高分离度，而无需添加任何物质，通常在30-60分钟后，添加电泳样品。
2.银染的步骤是什么？银染的关键因素是什么？
这些步骤是：
（1）固定：最低10％冰醋酸。
（2）清洁：用双蒸馏水冲洗凝胶两次，每次1分钟。
（3）染色：染色溶液（1g硝酸银，0.5mL 37％甲醛，1L双蒸馏水，现在配备）30分钟。
（4）清洁：迅速清洗凝胶。
（5）显影：碳酸钠30g，1.5mL 37％甲醛，200uL 10mg / L硫代硫酸钠。显影直至出现清晰的条纹。
成功进行银染的关键因素包括：
（6）使用超纯水（例如，NANOpure或Milli-Q纯化）或双蒸馏水进行银染。
（7）使用提供的碳酸钠或ACS试剂级碳酸钠。
（8）染色后，水洗的时间很重要，清洗胶水，然后将其放入一般浸在水中的显色溶液中，不超过5-10秒。
（9）在使用前及时将甲醛和硫代硫酸钠（ul / 1ml）加入显色溶液中。
（10）使用前应及时分配染色液。
3.变性PAGE的加载缓冲液配方？如何准备加载的蛋白质？超声或细胞裂解液会裂解细胞吗？大多数细胞裂解液均含有SDS。我不知道它是否用于裂解非变性PAGE。操作步骤是什么？
非变性PAGE缓冲区为0.5xTBE。加载缓冲液可以使用普通的加载缓冲液，该缓冲液包含Tris，溴芬兰和甘油。甘油是主要的沉淀成分。一切都可以自己准备。超声后可以使用细胞超声。离心收集上清液。还有用于NATIVE-PAGE凝胶的1 * TBE缓冲液和用于运行的缓冲液的1 * TBE缓冲液。另一点是考虑在混合凝胶时可以稳定蛋白质多聚体的因素。
4.我做过天真--- PAGE不带子，蛋白质很纯净，分子量很大，怎么回事？
因为分子量非常大，所以浓度为8％的胶水更为合适。加载样品时添加标记可以检测胶水的制备是否存在问题。如果蛋白质是一种酶，那么银染方法会更敏感，并且可以使特定的底物显色。如果需要，可以尝试使用反应性染色来进行，这种方法更敏感。
Native-PAGE注意一些问题
1.在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，蛋白质的迁移率不仅与蛋白质的等电点有关，而且与蛋白质的分子量和分子形状有关，其中蛋白质的等电点与蛋白质的等电点有关。蛋白质是最重要的
影响因素应基于蛋白质的等电点来选择相应的电泳缓冲液系统；
2.在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，应注意过高的电压会导致热量引起蛋白质变性，因此最好将冰块放在电泳槽外以降低温度；
3.如果蛋白质的分子量大，则可以适当延长电泳时间，以使目标蛋白质具有足够的迁移率以与其他蛋白质分离，反之亦然；
4.变性样品的离子强度不应太高（I<0.1mM）。将样品的pH值调节到约4.0，这对于是否可以很好地处理未变性的样品非常重要。样本缓冲区中没有SDS，加热。
