购物车 
MTT试验介绍
Release Time：2020-07-08一、实验原理
二、实验步骤：
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS号 | 备注 |
| 1 | 二甲基亚砜 | JY1172 | 67-68-5 | |
| 2 | 琥珀酸脱氢酶 | HC0558 | ||
| 3 | 细胞色素C | SD0004 | 9007-43-6 | |
| 4 | NaCl | JT0001 | 7647-14-5 | |
| 5 | KCL | JT0010 | 7447-40-7 | |
| 6 | Na2HPO4 | JT11318 | 7782-85-6 | |
| 7 | KH2PO4 | SS1343 | 7778-77-0 | |
| 8 | DMSO | HC1136 |
(1)贴壁细胞：
1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1 000-10 000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100 ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况，3.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4.每孔加入20 ulMTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5.终止培养，小心吸去孔内培养液。
6.每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。
7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）
（2）悬浮细胞：
1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40 ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培养液稀释1 ug/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100(储存液100 1640）。
2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570 nm（630 nm校准）测量各孔的吸光值）
4）离心（1000转x10 min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570 nm（630 nm校准）测量各孔的吸光值。
5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
（3）MTT的配制：
MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5 mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。
配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
PBS配方:
NaCl 8 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.24 g
调pH 7.4
定容1 L
（4）关于细胞的接种(铺板)：
细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10 000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10 000/ml，100 ul/孔。
细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105，贴壁细胞可为103-104。
进行细胞增殖分析的使用方法：
1、接种细胞悬液100 μl于96孔板内，预先置于37℃，5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
2、在每个孔内加入10 μl的CCK-8试剂。
3、把培养板放在培养箱内培养1-4小时*。
4、在450 nm波长处测定吸光度，参比波长为600 nm或600 nm以上。
解决方法3：使用MTS
（5）加入DMSO：
在同一批实验中最好不要更换DMSO。加DMSO前把孔中液体尽量弃干净，没有去掉上清直接加DMSO，一是沉淀会很难溶解.二培养液的颜色在检测时也能被测到,会对最后结果造成影响。但前提是不能把细胞也一起吸掉，因为这样带来的误差要远远大于培养液没弃干净带来的误差,所以要在保证细胞不被吸掉的前提下，尽量把培养液吸掉。如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO的量也可为100ul或150ul。
1.加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5－10min, 时间控制尽量严格一点,放置时间长了会影响结果,值会偏大,且结果不可信。
2.加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。如果实验孔不多，建议用此法，因其比振荡溶解效果好。
3.或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。
振荡是为了让甲臜溶解，这样才能更好的测量吸光度，振荡96孔板有专的振荡器，目的：扎破气泡.有气泡存在时,由于其对光的反射与折射作用(酶标仪的原理是通过测定特定波长透过样品的吸光度推测样品内特定物质的浓度),会导致结果偏移.
（6）OD值的测定：
至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490 nm有最大吸收值，而ATCC公司的MTT试剂盒用的不是DMSO，它的测定波长是570。(就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492，选用TMB显色液则用450)；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570 nm，并且建议以655nm作为参考波长。
DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而SDS做为溶解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变。
细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，OD值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是细菌污染。
复孔直接的OD值差别一般应在0.1－0.15，差别太大考虑：1.接种细胞数不均匀，或是接种太多，应保证每孔一致，一般是每孔1 000－10 000个。可以细胞细胞计数后，加入细胞悬液，再补培养基到预定体积，并轻轻吹打几次，使细胞均匀分布，这样比直接加入预定体积的细胞悬液要好，接种时应加含血清培养基。2.贴壁时间：18－24 h，如果不够，未悬浮的细胞会被吸掉。
一般为了实验的准确，每个浓度可以设5－6个复孔，可以最后统计时，可以除去一个最高值和一个最低值，或者除去其中数据离谱的值，这些离谱数字的出现与细胞是否污染，细胞是否在培养期间死去，是否培养液蒸发过多，加MTT液是否准确，在37℃，5%二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定（1－4小时）等有密切的关系，当然测定OD值的仪器工作状态是否正常也非常重要！(一般开机预热20 min)。
MTT方法的吸收度在0.2～0.8之间误差较小。这和分析化学中的lambert-beer定律有关， 对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象（吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。
在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器，读数的波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也越大透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。待测溶液的透射比T在15%~65%之间，或使吸光度A在0.2~0.8之间，才能保证测量的相对误差较小。当0.434(或透射比T=36.8%)时，测量的相对误差最小。
（7）关于如何计算IC50：
1.改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm:最大阳性反应率
Pn:最小阳性反应率
例如：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。
代入计算公式：
Pm=0.95
Pn=0.06
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025
2.Bliss法:自己查阅书籍
3.IC50计算软件，见下面附件
4.自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似！
5.在线求IC50或EC50：
（8）结果统计学处理：
所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。细胞死亡率%=OD对照组-OD实验组/OD对照组
excel表中可以做两两比较的T-test，这个你可以参考一下；你的数据应该用多个样本均数的T-test，方差分析也可。用的软件是SPSS或者SAS。
孔板的重复利用：
培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。建议不要用太多次，即使是进口的板子使用次数也不要超过3次,底值最好在测得值的1/3一下。
强烈建议培养板不要重复使用:1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利于细胞的生长，会出现帖壁不好，细胞生长缓慢等情况.2、这样的板子消毒灭菌很不彻底，如果有万一,则因小失大.3、重复用的板子洗不干净在培养过程中易出现杂质。
重复利用
方法1：
洗净后用2% NaoH浸泡4小时，再用1％稀盐酸浸泡4小时，冲洗15遍，蒸馏水冲洗3遍，烘干，UV照射过夜(紫外2小时以上消毒即可)
方法2：
泡酸2－4小时，老师让我们别超过4小时，（普通的玻璃仪器是过夜）。捞出，冲洗干净，烘干后，UV 照射过夜。估计跟其他收集在一起，钴60照射消毒.
方法3：
1.做完MTT后用大水流尽量将板冲净，然后用洗衣粉水泡几个小时（小心最好让洗衣粉先化开）。2.用自来水冲净洗衣粉水，倒扣晾干.3.重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液(六小时以上即可)后自来水洗净（20次左右）每个孔都要处理。4.用去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3遍，烤干。5.超净台中紫外线照射2个小时左右，就可以用了，不可以高压。
做法4:
1、测完值的96孔板甩掉孔内培养液，放入超声中超10-30分钟，晾干(或烘干)备用。
此步骤可最大程度的洗去污垢及细胞。
2、每孔加入50-100 ul的胰酶(0.05%)，我一般加60 ul，加完胰酶后水平振荡96孔板以使胰酶均匀覆盖于细胞表面，室温下放置至细胞被消化脱落为止。假如你想消化快一点的话可将96孔板放到37度培养箱内(胰酶在37度时的活力最大)。
对于顽固贴附在壁上的细胞，此步骤最为有效。
3、甩掉胰酶，自来水下冲洗，晾干(或烘干)备用。
如果不烘干就泡酸，那么96孔板残留的水分将稀释酸液，长期以往泡酸的效果下降。
4、将晾干的96孔板泡酸(中强酸)过夜，捞起后自来水下冲洗10遍；双蒸水冲洗3遍。三蒸水冲洗3遍。烘干备用。泡酸时特别注意时间不要太长了，否则板子变黄，影响最后的OD值的测定。
5、做实验前，96孔板至少在紫外灯下照射30分钟，但不能长期照射。紫外线长期照射可使板变黄，我的两块板放在超静台上忘了拿出来，一直照了两个星期，等我从超静台上取出板已经变成黄色。
三、MTT实验注意事项：
1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
4.培养时间。200 ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68 h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48 h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8.避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
