购物车 
荧光共振能量转移技术的基本原理和应用
Release Time：2020-07-07荧光共振能量转移技术的基本原理和应用
一、简单介绍：
荧光共振能量转移（FRET），作为一种有效的光学“分子尺”，在生物大分子，免疫测定和核酸检测的相互作用中具有广泛的应用。在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下的蛋白质-蛋白质相互作用。蛋白质-蛋白质相互作用在整个细胞生命过程中起着重要作用。由于细胞中极其复杂的成分，一些用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的传统方法，例如酵母双杂交，免疫沉淀等，可能会丢失一些重要信息。这些重要信息无法正确反映在蛋白质作用下蛋白质-蛋白质相互作用的动态变化过程。当时活细胞的生理状况。 FRET技术是最近开发的一项新技术，它有助于在活细胞的生理条件下实时动态研究蛋白质之间的相互作用。
| 序号 | 名称 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 萘基荧光素 | JSH62036 | 61419-02-1 |
二、FRET技术基本原理
?荧光共振能量转移意味着，当两个荧光生色团足够接近时，当供体分子吸收一定频率的光子时，它被激发到更高的电子能量状态。在电子返回基态之前，它会穿过偶极子。相互作用实现了向相邻受体分子的能量转移（即发生能量共振转移）。
FRET是一种无辐射的能量跃迁。通过分子之间的电偶极相互作用将能量从供体的激发态转移到受体的激发态的过程降低了供体的荧光强度，并且受体可以发射出比其自身更强的荧光。特征荧光（敏化荧光）可以发荧光或不发荧光（荧光猝灭），这还伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率与供体的发射光谱和受体的吸收光谱之间的重叠程度，供体和受体的跃迁偶极的相对取向以及供体和受体之间的距离有关。作为一对共振能量转移供体和受体，荧光物质必须满足以下条件：
①受主和供体的激发光应充分分开；
②供体的发射光谱和受体的激发光谱应重叠。
人们已经在研究对象上使用了有机体自身的荧光或标记的有机荧光染料，并将其成功地应用于核酸检测，蛋白质结构，功能分析，免疫学分析以及细胞器结构和功能检测等许多方面。 （传统的有机荧光染料吸收光谱很窄，发射光谱经常伴有拖尾现象。这会影响施主发射光谱与受体吸收光谱之间的重叠，施主和受体发射光谱会相互干扰。一些最新的报道将发光量子点被用于共振能量转移研究中，以克服有机荧光染料的缺点。
与传统的有机荧光染料分子相比，量子点的发射光谱非常窄且不拖尾，减少了供体和受体的发射光谱的重叠，避免了彼此之间的干扰。由于量子点具有较宽的光谱激发范围，因此当其用作能量供体时，可以更自由地选择激发波长，最大程度地避免了能量受体的直接激发。通过改变量子点的组成或大小，它可以发射可见光区域中任何波长的光，换句话说，它可以用作可见光谱中具有吸收光谱的任何生色团的能量供体，并且可以确保供体的发射波长和受体的吸收波长之间有良好的重叠，从而增加了共振能量转移的效率。 ）
以两个GFP突变体CFP（蓝绿色荧光蛋白）和YFP（黄色荧光蛋白）为例，简要解释其原理：CFP的发射光谱和YFP的吸收光谱有相当大的重叠。当它们足够接近时，使用受吸收波长激发的CFP，CFP发色团将发生共振并有效地将能量转移到YFP发色团，因此CFP发射荧光将减少或消失，主要发射将是YFP荧光。两个生色团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的六次方成反比，并且对空间位置的变化非常敏感。例如，为了研究两种蛋白质a和b之间的相互作用，可以根据FRET原理构建融合蛋白。该融合蛋白由三部分组成：CFP（蓝绿色荧光蛋白），蛋白b和YFP（黄色荧光蛋白）。
使用433nm的CFP吸收波长作为激发波长，对实验进行了灵巧的设计，使得当蛋白质a和b不相互作用时，CFP和YFP相距遥远，并且不会发生荧光共振能量转移。因此，在476nm荧光下检测到CFP的发射波长。然而，当蛋白质a与b相互作用时，蛋白质b的构象变化是由蛋白质a引起的，因此CFP和YFP足够接近以进行荧光共振能量转移。此时，检测到的YFP发射波长为527nm荧光。编码这种融合蛋白的基因通过转基因技术在细胞中表达，因此可以在活细胞的生理条件下研究蛋白质-蛋白质的相互作用。
三. FRET技术的应用
随着生命科学研究的深入，对各种生命现象发生机理的研究，尤其是细胞内蛋白质与蛋白质相互作用的研究，变得尤为重要。为了使这些领域的研究取得重大突破，技术进步至关重要。
一些传统研究方法的不断发展为蛋白质-蛋白质相互作用的研究提供了极为有利的条件，但同时这些研究方法也存在许多缺陷：例如酵母双杂交，磷酸化抗体，免疫荧光，放射性标记等。该方法应用的前提是破坏细胞或对细胞造成损害，并且不可能在活细胞的生理条件下实时动态地研究细胞内蛋白质与蛋白质的相互作用。 FRET技术与基因工程等技术的结合正好弥补了这一缺点。以下是FRET技术在相关生命科学领域的具体应用。
1.检测酶活性的变化
（1）检测活细胞中的蛋白激酶活性
蛋白质磷酸化是细胞信号转导过程中的重要标志，研究酶的活性是研究信号通路的重要方面。过去，酶活性的测定主要采用放射性和免疫化学发光法，但前提是要破坏细胞并用细胞提取物测定酶的活性。无法以定时，定量或局部的方式观察活细胞中酶活性的变化。
FRET方法可以很好地解决这个问题：Zhang等。根据FRET原理设计了一种新探针（融合蛋白）：新探针包含对已知蛋白激酶结构域具有特异性的底物，该区域是与磷酸化底物结构域结合的磷酸化识别域。该探针蛋白的两端是GFP衍生物CFP和YFP，它们使用FRET原理工作。
当底物结构域被磷酸化时，由磷酸化识别结构域及其结合引起的内部折叠将发生在分子内部，并且当两个荧光蛋白彼此靠近时将发生能量迁移。如果磷酸酶起磷酸去磷酸化作用，分子将发生可逆变化。该研究小组使用几组嵌合体来研究四种已知蛋白激酶的活性：PKA（蛋白激酶A），Src，Abl和EGFR（表皮生长因子受体）。
他们将构建的报告探针转移到细胞中，并使用FRET检测激酶活性的变化。用生长因子处理细胞后，在几分钟内激活了一些酪氨酸激酶，并检测到25％-35％的活性变化。用毛喉素激活PKA可以使FRET的变化提高25％-50％，并且激酶在整个细胞质中都被激活。如果将报告探针添加到核定位信号中以将其定位在核中，则FRET变化会大大延迟，这也表明PKA作用的区域性。可以看出，FRET方法可用于观察活细胞中酶活性的变化，并且可以定时，定量和定位，这是一种非常有效的研究方法。
