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分子标记——AFLP实验
Release Time：2020-07-07分子标记——AFLP
一、实验简介
AFLP是一种DNA分子标记技术，可通过不同长度的限制酶片段检测DNA多态性。
二、实验方法原理
AFLP首先通过PCR反应扩增消化的片段，然后在高分辨率的顺序分析凝胶上电泳扩增的消化片段，然后通过不同长度的扩增片段检测多态性。
在实验中，首先将消化的片段与包含粘性末端的人工接头连接在一起。粘性末端的序列和连接的序列用作随后的PCR反应的引物结合位点。在该实验中，通过选择根据需要在末端添加1至3个选择性核苷的不同引物，可以达到选择性扩增的目的。这些选择性核苷酸可使引物选择性地识别具有特定配对序列的核酸内切酶片段并结合，从而导致特异性扩增。
三、实验材料
Taq酶，EcoRI / MseIEcoRI / MseI接头，E + A引物M + C引物，T4DNALigaseE和M引物，琼脂，过硫酸胺，丙烯酰胺，尿素，硝酸银，甲酰胺，dNTPs，二甲苯绿，冰醋酸，玻璃硅烷，50bpMark。
四、操作步骤
（1）基因组DNA的纯化
使用0.8％琼脂糖凝胶（包括EB0.5μg/ ml）检测片段大小，取出提取的基因组DNA的1/3进行纯化，然后先用TE填充至总体积缓冲液50ul，然后提取等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）和氯仿/异戊醇（24：1）一次，离心以吸收Eppendorf管中的上清液，加入1/10体积的NaAC，并两次量的预冷无水乙醇，于-20℃放置2h以上，以10,000g离心10min，用70％乙醇冲洗DNA沉淀两次，风干并溶于30μlTE缓冲液UV-2401PC（用Shimadzu紫外分光光度计检测和定量A260和A280值，然后在0.8％琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ ml）上通过电泳检测片段大小。
注意：0.1-0.2g组织可以用100ul溶液E溶解，0.5g组织可以将溶液E增加到300ul，此时DNA浓度约为100ng / ul。
（2）限制酶切消化和结扎
加入0.2ml离心管中：模板量约为250ng，2.5μl10×消化缓冲液，2.5μl10×T4 DNA连接缓冲液，5UEcoRⅠ，5UMseⅠ，2U T4连接酶，50pmolMseⅠ衔接子，加倍蒸馏水至25μl，用PE Company的PCR扩增器在37°C下放置过夜后，将酶在65°C灭活20分钟，并在-20°C下保存作为预扩增模板。
（3）前置放大
取3μl消化的连接产物，加入75 ng E + A，75 ng M + C引物，15 mmol / L Mg2 +，25 mmol / L dNTPs，1U标签酶，3μl10×PCR缓冲液，并补足30μl加双蒸馏水。反应参数为：94℃90s; 94℃30s，56℃1min，72℃1min，30个循环； 72℃10min（PE公司PCR仪）。反应后，用0.8％琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ ml）检测扩增产物，并将3μl产物稀释50倍，用作选择性扩增模板。
（4）选择性PCR扩增
取3μl稀释产物，分别加入75ng EcoRI选择性引物和MseⅠ选择性引物，15mmol / L Mg2 +，25mmol / L dNTPs，1UTag酶，3μl10×PCR缓冲液，并用双蒸馏水补足至30μl。反应参数为：94℃90s； 94°C 30s，65°C 1min，72°C 1min，13个循环（每个循环0°C）; 94°C 30s，56°C 1min，72°C 1min，25个循环; 72°C 5min（PE公司的PCR仪器），首先使用0.8％琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ ml）电泳检测选择性扩增产物。
（5）凝胶电泳
用6％变性聚丙烯酰胺凝胶（厚度0.5mm）和1×TBE电泳缓冲液（BIO-RAD公司的测序电泳仪）分离扩增产物。拔出梳子，在140W恒功率下进行预电泳30分钟，温度达到47?49℃。确保从每个孔清洁尿素。将等体积的上样缓冲液（98％甲酰胺，10 mmol / LEDTA，0.25％的二甲苯，0.25％的溴酚蓝）添加到选择性扩增产物中，并在94°C变性5分钟（PE公司PCR仪器）。在冰上直到发现。向每个泳道添加8μl。在开始时，以100W恒定功率进行电泳约2分钟，以便将样品迅速浓缩到孔的底部，然后将其调整为60W恒定功率电泳，并将温度保持在约43°C直至二甲苯绿FF达到玻璃板的2/3，以结束电泳。
（6）染银
固定剂：将100毫升冰醋酸加入900毫升去离子水或双蒸馏水中。染色溶液：1g AgNO3、1.5ml 37％甲醛，加去离子水至1L。显色溶液：30g Na2CO3、1.5ml 37％甲醛，2mg硫代硫酸钠，并添加去离子水至1L。
①电泳完成后，将装有凝胶的玻璃板放入塑料皿中进行银染。
②固色剂：加入固色剂溶液，并在摇床上轻轻摇动30分钟。固定后，保留固定剂。
③加入去离子水冲洗3次，每次2分钟。
④染色：将凝胶放入染色盘中，倒入染色液（4℃），并在摇床上轻轻摇动30分钟。用去离子水冲洗凝胶10秒钟后，将其放入彩色显影皿中。
⑤显色：添加显色液（4℃），并在振荡器上轻轻摇晃，直到条带数不再增加。
⑥终止剂：加入步骤b中使用的固定剂，并来回浮动几分钟。达到最佳效果后，用蒸馏水冲洗几分钟。
⑦去除凝胶和玻璃板上的水滴后，将其放在白光灯箱上，用相机拍照。
一、实验简介
AFLP是一种DNA分子标记技术，可通过不同长度的限制酶片段检测DNA多态性。
二、实验方法原理
AFLP首先通过PCR反应扩增消化的片段，然后在高分辨率的顺序分析凝胶上电泳扩增的消化片段，然后通过不同长度的扩增片段检测多态性。
在实验中，首先将消化的片段与包含粘性末端的人工接头连接在一起。粘性末端的序列和连接的序列用作随后的PCR反应的引物结合位点。在该实验中，通过选择根据需要在末端添加1至3个选择性核苷的不同引物，可以达到选择性扩增的目的。这些选择性核苷酸可使引物选择性地识别具有特定配对序列的核酸内切酶片段并结合，从而导致特异性扩增。
三、实验材料
Taq酶，EcoRI / MseIEcoRI / MseI接头，E + A引物M + C引物，T4DNALigaseE和M引物，琼脂，过硫酸胺，丙烯酰胺，尿素，硝酸银，甲酰胺，dNTPs，二甲苯绿，冰醋酸，玻璃硅烷，50bpMark。
| 序列 | 产品名 | 货号 | CAS | 备注 |
| 1 | 琼脂粉 | SW0007 | ||
| 2 | 丙烯酰胺 | LSH54449 | ||
| 3 | 尿素 | JY0003 | ||
| 4 | 甲酰胺 | HXH504144 |
四、操作步骤
（1）基因组DNA的纯化
使用0.8％琼脂糖凝胶（包括EB0.5μg/ ml）检测片段大小，取出提取的基因组DNA的1/3进行纯化，然后先用TE填充至总体积缓冲液50ul，然后提取等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）和氯仿/异戊醇（24：1）一次，离心以吸收Eppendorf管中的上清液，加入1/10体积的NaAC，并两次量的预冷无水乙醇，于-20℃放置2h以上，以10,000g离心10min，用70％乙醇冲洗DNA沉淀两次，风干并溶于30μlTE缓冲液UV-2401PC（用Shimadzu紫外分光光度计检测和定量A260和A280值，然后在0.8％琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ ml）上通过电泳检测片段大小。
注意：0.1-0.2g组织可以用100ul溶液E溶解，0.5g组织可以将溶液E增加到300ul，此时DNA浓度约为100ng / ul。
（2）限制酶切消化和结扎
加入0.2ml离心管中：模板量约为250ng，2.5μl10×消化缓冲液，2.5μl10×T4 DNA连接缓冲液，5UEcoRⅠ，5UMseⅠ，2U T4连接酶，50pmolMseⅠ衔接子，加倍蒸馏水至25μl，用PE Company的PCR扩增器在37°C下放置过夜后，将酶在65°C灭活20分钟，并在-20°C下保存作为预扩增模板。
（3）前置放大
取3μl消化的连接产物，加入75 ng E + A，75 ng M + C引物，15 mmol / L Mg2 +，25 mmol / L dNTPs，1U标签酶，3μl10×PCR缓冲液，并补足30μl加双蒸馏水。反应参数为：94℃90s; 94℃30s，56℃1min，72℃1min，30个循环； 72℃10min（PE公司PCR仪）。反应后，用0.8％琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ ml）检测扩增产物，并将3μl产物稀释50倍，用作选择性扩增模板。
（4）选择性PCR扩增
取3μl稀释产物，分别加入75ng EcoRI选择性引物和MseⅠ选择性引物，15mmol / L Mg2 +，25mmol / L dNTPs，1UTag酶，3μl10×PCR缓冲液，并用双蒸馏水补足至30μl。反应参数为：94℃90s； 94°C 30s，65°C 1min，72°C 1min，13个循环（每个循环0°C）; 94°C 30s，56°C 1min，72°C 1min，25个循环; 72°C 5min（PE公司的PCR仪器），首先使用0.8％琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ ml）电泳检测选择性扩增产物。
（5）凝胶电泳
用6％变性聚丙烯酰胺凝胶（厚度0.5mm）和1×TBE电泳缓冲液（BIO-RAD公司的测序电泳仪）分离扩增产物。拔出梳子，在140W恒功率下进行预电泳30分钟，温度达到47?49℃。确保从每个孔清洁尿素。将等体积的上样缓冲液（98％甲酰胺，10 mmol / LEDTA，0.25％的二甲苯，0.25％的溴酚蓝）添加到选择性扩增产物中，并在94°C变性5分钟（PE公司PCR仪器）。在冰上直到发现。向每个泳道添加8μl。在开始时，以100W恒定功率进行电泳约2分钟，以便将样品迅速浓缩到孔的底部，然后将其调整为60W恒定功率电泳，并将温度保持在约43°C直至二甲苯绿FF达到玻璃板的2/3，以结束电泳。
（6）染银
固定剂：将100毫升冰醋酸加入900毫升去离子水或双蒸馏水中。染色溶液：1g AgNO3、1.5ml 37％甲醛，加去离子水至1L。显色溶液：30g Na2CO3、1.5ml 37％甲醛，2mg硫代硫酸钠，并添加去离子水至1L。
①电泳完成后，将装有凝胶的玻璃板放入塑料皿中进行银染。
②固色剂：加入固色剂溶液，并在摇床上轻轻摇动30分钟。固定后，保留固定剂。
③加入去离子水冲洗3次，每次2分钟。
④染色：将凝胶放入染色盘中，倒入染色液（4℃），并在摇床上轻轻摇动30分钟。用去离子水冲洗凝胶10秒钟后，将其放入彩色显影皿中。
⑤显色：添加显色液（4℃），并在振荡器上轻轻摇晃，直到条带数不再增加。
⑥终止剂：加入步骤b中使用的固定剂，并来回浮动几分钟。达到最佳效果后，用蒸馏水冲洗几分钟。
⑦去除凝胶和玻璃板上的水滴后，将其放在白光灯箱上，用相机拍照。
