BCECF-AM

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检测原理
※ 检测方法：流式细胞仪、共聚焦显微镜
※ 核仁是形成核的结构之一，并成为核糖体生物发生的起点。 核仁中有许多核糖体RNA（rRNA），进行rRNA的转录和加工。 虽然核仁的形态变化被认为是癌症诊断的指标之一，但也有一些科学报道描述了核仁与 DNA 损伤、自噬、病毒感染和细胞衰老之间的关系。 Nucleolus Bright 染料是小分子，它们与核仁中的 RNA 结合以发射荧光。 用 Nucleolus Bright 染料染色后，无需任何洗涤步骤即可观察到核仁。
Nucleolus Bright 对存在于核仁之外的 RNA 起反应，但它在核仁中显示出强烈的荧光，这是 rRNA 产生的位点。 我们建议与 DAPI 共同染色，以便清晰地成像核仁。

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BCECF, AM(117464-70-7) 介绍：
BCECF被广泛地用于细胞内pH的测定。加入2个额外的羧化物基团改进了这种羧基荧光素。加入的两个羧基使得它能更好地被固定在细胞内。BCECF具有很好的水溶性，是因为它在中性pH时带有4-5个负电荷。但是BCECF却很难穿过细胞膜进入到细胞内。它的pKa值为6.97，高于其它的羧基荧光素。BCECF在激发光谱439nm处有等吸收点，因此它能和Fura 2一样可用比率法测定。505nm和439nm通常是非常有用的用于比率测量的波长，一般会将490nm和450nm的滤光片加在激发光源的前面。而530nm的滤光片则是用来查看它的荧光信号的。这里要注意的是激发光谱与吸收光谱有一些细微的区别。

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BCECF,AM的优越特性： BCECF的AM 形式的乙酰酯衍生物具有膜透性，可以被动穿过细胞膜。且 BCECF AM 本身不发出荧光，通过胞内酯酶作用后成为 BCECF 发出荧光信号，可以作为细胞活力的判断依据之一。 修饰 AM 乙酸酯集团上的羧酸，使之不带电荷，可以渗透进入细胞膜，一旦进入细胞，其亲脂保护基团可以被酯酶非特异性的脱去，成为带电荷形式，相较于原来的 AM 形式，带电荷形式在胞内可以更久的滞留。 BCECF 也用于灌注组织，细胞间隙，植物细胞，对细菌和酵母进行 pH 测量。BCECF AM 可以用于检测细胞生存能力，细胞毒性，凋亡、粘附和多药耐药性以及趋化性等多种功能性检测。
BCECF-AM是乙酰甲酯化的BCECF。它能够轻易地进入到细胞内。就和其他的乙酰甲酯类一样，BCECF-AM只需要通过孵育就能进入细胞。BCECF-AM对潮湿非常敏感，所以要小心保存。如果DMSO储存液的颜色从浅黄色变为深橙色就代表了AM的分解。所以通过对颜色变化的观测，能判断AM酯的水解情况。

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BCECF/AM, a membrane-permeable fluorescent indicator for the measurement of cytoplasmic pH with an Abs/Em = 503/520 nm. BCECF/AM readily and rapidly diffuses through cell membranes. BCECF/AM is an acetoxymethyl ester of BCECF, is a variable mixture of cell-permeable ester derivatives of BCECF that are hydrolyzed by cytosolic esterases to yield intracellularly trapped indicator BCECF. BCECF/AM is a selective vacuolar accumulation of the fluorescent pH-indicator used to monitor intracellular pH changes in mammalian fibroblasts, gastric cells, lymphocytes, myocytes, and distal convoluted tubules.

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BCECF-AM不仅被广泛用于哺乳动物细胞的研究，也有报道用于动物组织、植物细胞、细菌和酵母等的细胞内pH水平检测。在有细胞内pH变化的细胞毒性、细胞凋亡、细胞粘附、药物抵抗、细胞趋化等过程中BCECF AM被广泛应用。BCECF-AM(pH荧光探针)需用无水DMSO(anhydrous DMSO)配制。

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	Maximum Excitation Wavelength	Maximum Emission Wavelength	Fluorescence of MeOH fixed cells	Fluorescence of PFA fixed cells
Nucleolus Bright Green	513 nm	538 nm	〇	〇
Nucleolus Bright Red	537 nm	605 nm	〇	〇

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核仁检测
用 4% PFA 或 MeOH 固定 HeLa 细胞后，用 PBS 洗涤细胞，然后用 1% Triton X-100 透膜。 加入核仁亮绿或核仁亮红 (N512) 和核染色染料 DAPI，并使用共聚焦显微镜成像。观察到 DAPI 染色的细胞核（蓝色）中的几个核仁。

<染色条件>
- 用 PFA 固定
将细胞浸入 4% PFA 中 5 分钟，Triton X-100 中 20 分钟。 然后在每个荧光探针中孵育 60 分钟。
- 用甲醇固定
将细胞浸入冷 MeOH 中 1 分钟，Triton X-100 中 20 分钟。 然后在每个荧光探针中孵育 5 分钟。

<检测条件>
核仁亮绿色 Ex. 488nm / Em. 500-600nm
核仁鲜红 Ex. 561nm / Em. 565-650nm
DAPI Ex. 405nm / Em. 450-495nm

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核仁定位
第 3 代 WI-38 细胞用 4% PFA 固定，用抗原纤维蛋白一抗和二抗进行免疫染色。 加入核仁亮绿或核仁亮红 (N512) 和核染色染料 DAPI，并使用落射荧光显微镜 (Keyence, BZ-X710) 进行成像。

<检测条件>
核仁亮绿色：Ex. 450-490 nm / Em. 500-550 nm
核仁亮红色：Ex. 533-548 nm / Em. 570-640 nm
DAPI：Ex. 340-380nm / Em. 435-485nm
抗原纤维蛋白抗体：Ex. 590-650 nm / Em. 668-733 nm

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检测衰老细胞
不同代的 WI-38 细胞用 4% PFA 固定并用 PBS 洗涤。 然后用 1% Triton X-100 渗透膜。 加入核仁亮绿或核仁亮红 (N512) 和核染色染料 DAPI，并使用共聚焦显微镜成像。

<染色条件>
将细胞浸入 4% PFA 中 5 分钟，Triton X-100 中 20 分钟。 然后在每个荧光探针中孵育 5 分钟。

<检测条件>
核仁亮绿色：Ex. 488 nm / Em. 500-600 nm
核仁亮红色：Ex. 561 nm / Em. 565-650 nm
DAPI：Ex. 405nm / Em. 450-495nm

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用共焦定量图像细胞仪进行定量
不同传代数的WI-38细胞固定后用Nucleolus Bright Green和DAPI染色。 然后使用共焦定量图像细胞仪 CQ1 分析每个染色的细胞。通过成像数据分析核仁在 405 nm 和 488 nm 处测量细胞核和核仁成像数据作为发射波长，并通过 CellPathfinder 分析细胞核中的核仁数量。

核仁数目分析
如第 19 代细胞中所见，含有一个核仁的细胞比例增加，而含有一个以上核仁的细胞减少。该结果与已发表报告的数据一致。 一份报告表明，衰老的 WI-38 细胞中的核仁数量减少了。 另一份报告表明，SETD8 敲低衰老细胞中的核仁数量和总面积发生了变化。

*1 P. M. Bemiller, L. Lee, “Nucleolar changes in senescing WI-38 cells”, Mech. Ageing Dev., 1978, 8 , 417.
*2 H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep., 2017, 18(9), 2148.

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Excitation & Emission

BCECF, AM(117464-70-7)实验注意事项：
1.实验前需戴好防护眼镜，穿戴防护服和口罩，佩戴手套，避免与皮肤接触。
2.实验过程中如遇到有毒或者刺激性物质及有害物质产生，必要时实验操作需要手套箱内完成以免对实验人员造成伤害
3.实验后产生的废弃物需分类存储，并交于专业生物废气物处理公司处理，以免造成环境污染Experimental considerations:
1. Wear protective glasses, protective clothing and masks, gloves, and avoid contact with the skin during the experiment.
2. The waste generated after the experiment needs to be stored separately, and handed over to a professional biological waste gas treatment company to avoid environmental pollution.